群体感应抑制活性海洋微生物的筛选与抑制因子活性评价
细菌耐药性系指病原菌对于抗菌药物作用的耐受程度,细菌产生对抗生素不敏感的现象。细菌耐药性已成为当今医学研究领域的一个重大难题。病原菌引起人体感染是其自身能够产生多种毒力因子,许多病原菌毒力因子的产生都依赖于细菌群体感应系统的调节和控制,实验证明群体感应系统突变或缺陷的病原菌致病能力显著下降,群体感应抑制因子与传统抗生素的作用机制不同,它不干扰细菌的正常生长,而是直接抑制病原菌的毒力因子的生成,因此,理论上能够缓解细菌耐药性的产生。本研究主要目的是从海洋微生物的次级代谢产物中筛选群体感应抑制因子。
本文利用铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)群体感应筛选模型PAOMWI(pW-4)和紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)群体感应指示菌株CV026对海洋微生物发酵粗提物进行活性测试,PAO MWI(pW-4)利用群体感应调控基因lasB启动子和缺失启动子的蔗糖致死基因sacB构建而成,外源加入信号分子和蔗糖能够诱导sacB表达杀死细菌,若存在抑制因子致死作用将会得到补救；信号号分子能够诱导CV026产生紫色菌素,若有群体感应抑制因子存在,紫色菌素产量将会降低。经筛选发现1株放线菌和2株真菌粗提物具有群体感应系统抑制活性,其中菌株QY013抑制活性最强,其18S rDNA序列与NCBI数据库比对,发现该菌株与Penicillium decumbens(斜卧青霉)进化距离最近,相似性最高。目前,还没有报道该类青霉种属具有群体感应抑制活性。对菌株QY013进行发酵培养,在其发酵培养液中分离得到活性单体化合物1个,利用核磁(1HNMR,13C NMR)等方法鉴定其为-5,6二氢-4-甲基-2H-吡喃-2-酮,本研究首次证明该吡喃酮类化合物具有抑制铜绿假单胞菌和紫色杆菌群体感应系统的活性。在不影响细菌生长的浓度范围内,该化合物能显著降低铜绿假单胞菌和紫色杆菌群体感应调控的毒力因子,如弹性蛋白酶的活性、绿脓菌素产量,紫色菌素产量,抑制生物被膜的形成；RT-PCR技术证明该化合物能显著降低QS调控相关基因的表达水平。
革兰氏阴性菌群体感应信号分子在化学结构上具有一定的相似性,主要差别在于内酯环上的脂肪酸碳链(C)长度和饱和度,根据这种相似性和差别,我们对海洋化合物库中的化合物进行比较,利用筛选模型对18个与信号分子结构相似的化合物进行群体感应抑制活性测试,发现4个化合物具有群体感应抑制活性,编号HD-ZWM-242的化合物为已知化合物青霉酸,该化合物已有报道具有铜绿假单胞菌群体感应抑制活性。编号HD-ZWM-169的化合物能够干扰铜绿假单胞菌和紫色杆菌两种病原菌的群体感应系统,在非抑菌浓度范围内,HD-ZWM-169能够降低铜绿假单胞菌弹性蛋白酶的活性,绿脓菌素的产量,抑制紫色杆菌紫色菌素的生成,抑制铜绿假单胞菌Swarming运动性,RT-PCR验证该化合物能够降低群体感应调控相关基因的表达。
本研究所发现的群体感应抑制因子与传统抗生素类药物作用机理不同,只抑制病原菌群体感应调控的毒力因子,但不会对细菌的正常生长产生选择性压力,理论上能够降低细菌耐药性产生的概率。因此,本研究是一项具有重要理论指导意义的基础研究,为解决细菌耐药性问题提供了新思路,为海洋活性物质的研究与开发引入了新的理念和方法。
细菌耐药性;群体感应;海洋微生物;抗菌药物;抑制因子
中国海洋大学
硕士
生药学
于文功
2011
中文
R282.77
112
2011-10-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）