斑马鱼缺氧诱导因子-3α核定位信号的研究
缺氧诱导因子(HIFs)是最主要的能够应答细胞内氧气浓度的降低而对多种基因进行调控的转录因子家族,与生物体的生长、发育及一些疾病的发病机理都有着密切的联系。由于生物体内缺氧现象较为普遍,所以有关HIF的结构、功能以及与多种疾病之间的关系等一直是热门的研究领域。HIF是一种异源二聚体蛋白,由α亚基和β亚基组成,其中α亚基受细胞内氧气浓度精密调控,对HIF功能的发挥是十分关键的。哺乳动物中HIF-α一共有三个成员,分别称为HIF-1α,HIF-2α和HIF-3α,三者在蛋白结构上较为保守。在缺氧状态下,HIF-α得到稳定积累并进入细胞核与HIF-1β结合形成有功能的转录复合体调控相关基因的表达。
根据对HIF-1α和HIF-2α的研究可知,HIF-α无论在蛋白稳定性还是其对靶基因的转录激活功能方面都受到细胞内多条途径的调节。作为转录因子,HIF-α蛋白是否能从细胞质成功被转运进入细胞核是其发挥功能的前提,所以针对HIF-α在细胞中亚定位的研究十分必要。已知分子量大于50kDa的蛋白质不同于小分子,它们需要通过消耗能量的主动运输过程才能穿越核孔复合体进入到细胞核中,在这些蛋白结构上往往存在特殊的核定位信号(NLS)使得能够蛋白质被成功转运入核内。文献报道,在细胞中检测外源性或内源性的HIF-1α和HIF-2α蛋白发现两者均能够定位于细胞核中,并且缺氧能够诱导两种蛋白的表达全部集中于核内。在HIF-1α和HIF-2α的蛋白结构中,研究者已经发现并证明了核定位信号存在的具体位点。在它们的C-端区域都包含有一段富含碱性氨基酸(Lys和Arg)的片段,当这些氨基酸被删除或被替换成其它氨基酸时蛋白便完全失去进入细胞核的能力。然而,由于HIF-3α较前两者较晚被克隆得到,所以目前对该蛋白是否也为核内蛋白,其进核能力是否会受到氧气浓度的影响以及该蛋白结构上是否也存在核定位信号等等一系列的问题尚未得到解答。本研究的目的就是要对上述疑问一一进行探讨。以斑马鱼Hif-3α作为对象观察该蛋白在细胞中的核质分布以及确定其核定位信号存在的位点。从斑马鱼体内克隆得到了hif-3α的全长cDNA,其开放阅读框共编码626个氨基酸。通过氨基酸序列比对发现该蛋白和人类的HIF-3α相似性在40％左右,说明两者的保守性比较高。利用Hif-3α进行核定位信号的研究能够帮助我们完善对三种HIF-α亚基在结构上相同点和不同点的认识。
将Hif-3α蛋白全长以及缺失N-端或C-端氨基酸片段的突变蛋白与EGFP构建成融合蛋白后用相应的质粒瞬时转染Hela细胞后发现,在常氧时Hif-3α-EGFP蛋白便已能够集中于细胞核分布,缺氧并不能对它的细胞亚定位产生影响。而N-端或C-端区域缺失突变体转染结果提示Hif-3α的C-端区域具有进核的功能。利用特异性表达于细胞质的β-Gal—EGFP蛋白进一步实验证明Hif-3α的C-端第518-567位和第568-626位两个氨基酸片段各自具备进核的功能。在每个片段中都存在碱性氨基酸对其功能的发挥有不可或缺的作用,它们分别为K524,R525,K578以及R579。在Hif-3α完整蛋白的背景下将这些氨基酸突变后也使得蛋白的进核能力明显减弱。在这两个碱性氨基酸簇之间有一段长为52个氨基酸的连接区域,这些氨基酸共同组成一段有核定位功能的结构域,将其命名为Hif-3α的核定位信号。值得注意的是,发现Hif-3α N-端的第1—69位氨基酸片段也能够介导β-Gal-EGFP进入细胞核中,其中发挥作用的氨基酸为R14,K15,R25和R26。但是在全长蛋白中该片段却并没有真正的核定位功能,这与之前在HIF-1α和HIF-2α中的研究结果相一致。最后将不同物种一共9种HIF-α的C-端序列进行比对,推测在Hif-3α中新发现的核定位信号的碱性氨基酸在HIF-α是保守存在的。
综上所述,斑马鱼Hif-3α是一种不受氧气浓度影响集中于细胞核分布的蛋白质,在其C-端存在一段有功能的核定位信号,其中几个碱性氨基酸发挥主要的核定位功能。
缺氧诱导因子;核定位信号;细胞质;细胞核;斑马鱼
中国海洋大学
硕士
生药学
李筠
2011
中文
R363
67
2011-10-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）