大菱鲆翻译控制肿瘤蛋白C末端半胱氨酸残基的生物学功能研究
翻译控制肿瘤蛋白(Translationally Controlled Tumor Protein,TCTP)是一种广泛存在于动物、植物和真菌中的高度保守、广泛表达、表达丰度较高的蛋白,参与多种生物学过程,具有促生长、结合钙离子、促进组胺释放、抗疟疾、抗氧化等多种生物学功能,在细胞内具有重要的生物学地位。由于TCTP的表达在转录和翻译水平上都受到高度的调控,因此研究其结构与功能之间的关系具有重要的理论和实际意义。我们对已知的TCTP蛋白序列进行同源比对分析时发现,大多动物的TCTP蛋白C末端高度保守,都是一个半胱氨酸(Cys)。尤其是大菱鲆(Scophthamus maximus)翻译控制肿瘤蛋白(SmTCTP)只有1个Cys(aa170),而这个Cys就位于该蛋白的C末端。因此,探讨该蛋白末端Cys对其生物学功能的贡献对于揭示该蛋白的作用机制具有重要的科学意义。
已有研究表明马来丝虫(Brugia malayi)TCTP蛋白的抗氧化功能与其分子内中间3个Cys(aa63、aa81和aa92)有关,因此本文首先通过Cys→Ala突变的方法探讨了SmTCTP蛋白末端Cys对其抗氧化功能的贡献。本文根据已知的SmTCTP序列,设计突变引物,成功构建了170Cys→Ala突变的重组表达质粒(pET30a-Mutant-SmTCTP)。然后分别将空载体质粒(pET30a)、未突变SmTCTP表达质粒(pET30a-wild-SmTCTP)和突变表达质粒(pET30a-Mutant-SmTCTP)转化到大肠杆菌表达菌株BL21中,比较和分析了这三种表达菌株对氧化剂H2O2的抗氧化能力。结果显示,在较低H2O2浓度(0.22 mM)条件下,wild-SmTCTP表达菌的抗氧化率最高,pET30a空载菌次之,Mutant-SmTCTP表达菌最低；当H2O2浓度达到0.44 mM时,即使以较高浓度菌液涂板,三种菌株平板上都看不到任何菌落的生长了。这表明Wild-SmTCTP具有抗氧化作用,但抗氧化能力不高,0.44 mM的H2O2已超出了其承受极限；Cys残基对SmTCTP蛋白的抗氧化性是必须的,因为Cys残基的缺失明显降低了表达菌的抗氧化性。但是,Mutant-SmTCTP表达菌的抗氧化能力明显低于pET30a空载菌又提示我们,Mutant-SmTCTP的表达对宿主菌是有毒性的。
为了进一步验证Mutant-SmTCTP的表达对宿主菌的毒性,本文又对以上三种表达菌株(pET30a、pET30a-Wild-SmTCTP和pET30a-Mutant-SmTCTP)的生长曲线进行了测定。结果表明,Wild-SmTCTP的表达可促进BL21菌株的生长,Mutant-SmTCTP的表达则明显抑制了BL21菌株的生长,也就是说,SmTCTP的C末端Cys残基的缺失同样影响了细菌的生长。
最后,我们通过瞬时转染技术在体外培养鱼类细胞-牙鲆鳃细胞系(FG)中进一步研究了SmqTCTP C末端Cys残基的突变对其促生长功能的影响。我们分别将wild-SmTCTP和Mutant-SmTCTP基因的编码区克隆到哺乳动物细胞表达载体pcDNATM3.1／V5-His中,利用Lipofectamine LTX转染剂,将pcDNA空载体质粒、pcDNA-Wild-SmTCTP质粒和pcDNA-Mutant-SmTCTP质粒转化到FG细胞中,过表达,比较转染后3种FG细胞的生长情况。结果显示,Wild-SmTCTP的过表达可促进FG细胞的生长,Mutant-SmTCTP的过表达则明显抑制FG细胞的生长。这表明SmTCTP蛋白的促生长功能与其C末端的Cys残基有关。
为了解释SmTCTP蛋白C末端Cys影响其促生长功能的机制,我们还预测了SmTCTP蛋白的三维晶体结构。发现,C末端Cys残基位于蛋白的表面,Cys→Ala的突变是不会影响蛋白的空间结构的。因而认为,C末端Cys残基的突变是通过影响SmTCTP蛋白之间的二聚体化,或者SmTCTP蛋白与其受体的二聚体化来影响其促生长功能的。
综上所述,本文认为Cys残基的-SH基具有还原性,是SmTCTP蛋白抗氧化能力的主要来源,但由于SmTCTP蛋白只有1个Cys残基,因而SmTCTP蛋白的抗氧化能力不高；SmTCTP蛋白可能和生长激素具有相似的促生长机制,即SmTCTP蛋白首先与细胞膜上受体结合,然后通过SmTCIP蛋白的二聚体化使受体靠近,从而激活受体。
大菱鲆;翻译控制肿瘤蛋白;牙鲆鳃细胞;C末端;半胱氨酸残基;生物学功能
中国海洋大学
硕士
生物工程
郭华荣
2011
中文
Q959.486
76
2011-10-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）