龙须菜热激蛋白70(HSP70)基因克隆及热激下的表达模式分析
龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)是一种产琼胶的重要经济红藻,原产地为山东省和辽宁省,现在广东、福建、浙江等地已成功实现南移栽培。南移栽培的龙须菜品系主要为981龙须菜,其适应海水温度可达26℃,但其在南方自然海域仍不能成功渡夏,因此培育耐高温龙须菜新品系,研究龙须菜的高温胁迫响应机制一直是研究者关注的问题。
热激蛋白(HSPs)是一类在生物体受到逆境胁迫时能提高机体耐受性的逆境蛋白家族,在减轻逆境胁迫对机体的伤害方面起到很大作用。HSP70是其重要组成成员,是提高生物体对温度耐受力的关键因子之一。本实验室前期通过构建龙须菜高温胁迫差异表达的cDNA文库,筛选得到了高丰度的龙须菜hsp70基因的表达序列标签,表明HSP70在龙须菜的高温胁迫响应中也起重要作用。本研究以耐高温品种981龙须菜和野生型龙须菜为主要材料,采用RACE技术和Genome Walking方法对龙须菜热激蛋白hsp70进行克隆,首次在龙须菜中获得两条hsp70基因(hsp70-1和hsp70-2)全长序列,推测得到其相应的氨基酸序列,并通过生物信息学的方法分析二者的结构特征和进化地位,使用荧光定量RT-PCR技术探讨981和野生型龙须菜在不同温度不同胁迫时间下,热激蛋白HSP70 mRNA表达水平的变化规律。主要研究结果如下:
获得两条hsp70基因序列(hsp70-1和hsp70-2),均含有三个典型的HSP70家族的序列标签,且5’非编码区域(UTR)有TATA Box和CAAT Box,3’UTR区有PolyA寡聚腺甘酸。其中,hsp70-1基因全长2582bp,仅由一个外显子组成,开放阅读框(ORF)长1977bp,编码658个氨基酸,分子量约为71.69kD,5’UTR为484bp,3’UTR区为121bp,其中5’UTR含有热激元件HSE。hsp70-2基因全长2843bp,也由一个外显子组成,ORF为2001bp,编码666个氨基酸,分子量约为72.88kD,5’UTR区730bp,3’UTR区112bp,有内质网定位序列HDEL。经NCBI Blastn比对二者的核苷酸相似性为69％,同源性比对表明,龙须菜HSP70-1与条斑紫菜(Pophyrayezoensis)HSP70同源性最高,为92％；龙须菜HSP70-2与领鞭毛虫(Monosiga brevicollis)Mb_ERHSP70同源性最高,为77％。
热激后(28℃和32℃),进行Real-time PCR结果表明:野生型实验组HSP70-1在热激短时间内表达量有所上升,而HSP70-2表达量始终低于对照组,且32℃实验组比28℃实验组表达量更低:981龙须菜实验组两种热激蛋白均呈现先上升后下降又上升的趋势,热激温度越高,表达高峰到来的越早,表达量更大,而且随着热激时间延长,表达量将更高。HSP70-1的表达水平高于HSP70-2,推测在龙须菜受热激胁迫过程中,HSP70-1发挥主导作用。综合比较野生型龙须菜和耐高温品种981龙须菜在高温胁迫下HSP70的表达情况,可以看出981龙须菜热激蛋白HSP70表达水平明显高于野生型龙须菜,而且表达持续时间更长,这可能与981龙须菜的耐高温性能更强直接相关。该研究结果为研究龙须菜高温胁迫响应机制提供了分子基础,为龙须菜耐高温品种选育提供了可用的基因信息。
龙须菜;热激蛋白;基因克隆;高温胁迫;表达模式
中国海洋大学
硕士
生物工程
臧晓南
2011
中文
S968.43;Q785
84
2011-10-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）