壳聚糖酶的分离纯化及酶基因在解脂耶氏酵母中的表达
壳寡糖具有许多独特的生理活性及功能性质,如增强机体免疫力、抗肿瘤、抑菌等,在医药、农业、食品等领域有着广泛的应用。壳聚糖酶是专一性降解壳聚糖的水解酶,可用于功能性壳寡糖的制备。本研究的主要目的是构建高效表达壳聚糖酶的工程菌株,以解决目前壳聚糖酶产量低、成本高等问题,同时为壳寡糖的制备提供有效途径。
Microbacterium sp.是本实验室已筛选得到的产壳聚糖酶菌株,在此基础上,本论文报道了Microbacterium sp.壳聚糖酶的分离纯化、壳聚糖酶基因在解脂耶氏酵母中的表达及重组酶的性质等研究。
采用硫酸铵盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephacryl S-100凝胶层析相结合的方法对Microbacterium sp.粗酶液进行了分离纯化,得到电泳纯壳聚糖酶B,纯化倍数为9.9,回收率为20.5％。SDS-PAGE凝胶电泳显示单一条带,其相对分子质量约为33.8 kDa。酶解产物质谱分析表明壳寡糖主要为四糖、五糖,部分二糖及三糖,无单糖,说明此酶为内切酶。酶N端氨基酸序列为ETAGTVDLDAPVQKDT。
根据酶N端测序结果及已注册壳聚糖酶序列设计引物,以Microbacterium sp.基因组为模板扩增得到约1000 bp特异性片段,序列分析表明含有完整的壳聚糖酶编码基因,其开放阅读框为801 bp,编码266个氨基酸残基,属于糖苷水解酶46号家族。该基因前26个氨基酸为信号肽,其N端推导序列与测序结果一致。
壳聚糖酶基因表达采用解脂耶氏酵母表达体系。目的基因与表达载体pINA1317经限制性内切酶SfiⅠ、KpnⅠ双酶切后,连接,构建重组载体。重组载体.NotⅠ酶切线性化后转化Yarrowia,lipolytica Polh。采用YNB平板筛选阳性转化子。菌落PCR表明目的基因整合入酵母基因组中。转化子接种于PPB培养基(蔗糖2 g,酵母粉0.132 g,氯化铵0.132 g,磷酸二氢钾0.032 g,无水硫酸镁0.0132 g,硫胺素0.0334 mg,溶于100 ml pH7.0100 mM柠檬酸盐缓冲液),28℃培养120 h,发酵上清液酶活力可达10.4 U／ml,是Microbacterium sp.上清液酶活力的3.15倍。
转化子粗酶液经DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析得到电泳纯重组壳聚糖酶。SDS-PAGE及Western blotting鉴定了重组蛋白的表达,重组酶相对分子量偏大,为41kDa,可能与酵母表达体系的糖基化有关。酶学性质研究表明重组酶最适反应温度45℃,最适反应pH为5.6,缓冲体系为0.2 M乙酸盐缓冲液。重组酶在pH5.0-7.0、25℃以下具有较好的稳定性。Na+对酶活力有一定的促进作用；Ag+、Fe3+具有较强的抑制作用,其中Fe3+(5 mM、10 mM)、Ag+(10 mM)完全抑制酶活力。以壳聚糖为底物,重组酶的Km值为0.926 mg／ml,Vmax为6.15 U／ml。酶解产物主要为三糖、五糖,降解专一性较好。
本研究通过构建相关表达载体及工程菌株,实现了壳聚糖酶在解脂耶氏酵母中的分泌表达,并对表达蛋白进行了相关的生物活性鉴定,为壳聚糖酶的工业化生产奠定了理论基础。
壳聚糖酶;分离纯化;重组酶;基因表达;解脂耶氏酵母
中国海洋大学
硕士
海洋生物学
刘万顺
2011
中文
Q539.4;Q784
79
2011-10-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）