单环刺螠(Urechis unicinctus)交替氧化酶基因的克隆及其诱导表达

李金龙

中国海洋大学

摘要：

硫化物(H2S、HS-、S2-)是一种广泛分布的有毒物质,它能够抑制线粒体电子传递的终端氧化酶——细胞色素氧化酶,从而增加活性氧的产生,造成机体氧化胁迫甚至导致最终的死亡。然而一些栖息于富硫环境的海洋无脊椎动物却具有耐受、代谢和利用硫化物的能力。沿岸底栖动物——单环刺螠已被揭示具有一定的耐受和代谢硫化物的能力,本实验我们定位在线粒体硫化物氧化电子传递分支途径中的一个关键酶——交替氧化酶,开展其基因克隆、硫化物暴露下其mRNA表达分析,以期揭示单环刺螠AOX的生物学特性；进一步在硫应急下,通过该基因的表达和细胞色素c氧化酶的活性变化,分析了单环刺螠在硫化物环境中的适应能力,为深入探讨硫化物代谢的分子机制提供科学依据。
采用同源克隆策略并结合RACE技术克隆获得单环刺蜢交替氧化酶全长cDNA序列,长1725 bp,其中5’UTR(Untranslated Reagion,非编码区)为288 bp；3’UTR为390 bp；开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)长1047 bp,编码348个氨基酸。蛋白理论分子量为39.49kDa,理论等电点pI为8.49；氨基酸序列中含有AOX所特有LET,NERMHL,LLEEA,及REDE H4个保守区,并含有1个泛醌结合位点(Q-binding site)；TMMHM预测显示该蛋白具有2个跨膜区域(TMHelixⅠ170-192 aa and TMHelixⅡ233-255 aa)。
采用荧光相对定量PCR技术检测显示了硫化物暴露后,单环刺螠体壁和呼吸肠AOX mRNA表达呈现浓度-时间递增的关系。在50μM及150μM硫化物浓度下两个组织的AOX mRNA表达均呈显著性增高,并随着暴露时间的延长,持续升高。
对单环刺螠体壁和呼吸肠线粒体细胞色素c氧化酶活性检测结果显示,酶活性在硫化物暴露6 h时到达最大值,随着暴露时间的延长,其活性下降。150μM硫化物暴露组的虫体在48 h时活性被完全抑制。
本实验硫化物暴露下,单环刺螠AOX mRNA的表达与细胞色素c氧化酶活性呈现负相关,说明AOX在单环刺螠硫化物氧化解毒中起着重要的作用。

关键词：单环刺螠;交替氧化酶;基因克隆;诱导表达;生物学特性

授予单位：中国海洋大学

授予学位：硕士

学科专业：海洋生物

导师姓名：张志峰

学位年度：2011

语种：中文

分类号：Q785;Q958.8

页数：71

在线出版日期：2011-10-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）