文昌鱼胰蛋白酶基因的鉴定、表达和功能研究
胰蛋白酶(Trypsin)是动物消化道中一种主要的蛋白水解酶,属于丝氨酸蛋白酶家族,能专一性水解赖氨酸或精氨酸羧基形成的肽键。胰蛋白酶已在多种物种中被鉴定。文昌鱼是现存的与脊椎动物原始祖先最接近的头索动物,一直被认为是研究脊椎动物起源和进化的模式动物。但是迄今对文昌鱼中胰蛋白酶的了解甚少。本研究克隆了青岛文昌鱼(Branchiostomajaponicum)胰蛋白酶原,并对其结构、进化、表达和功能进行研究。
首先,我们应用RACE技术克隆到青岛文昌鱼胰蛋白酶cDNA(Bjtry),全长为978bp,其最大开放阅读框编码272个氨基酸的蛋白质(BjTRY),分子量为29kDa。该蛋白质有一长为15氨基酸的信号肽,紧接着是一段16个氨基酸的激活肽。它同脊椎动物的胰蛋白酶一样,在氨基酸序列的32.259位具有一个完整的Tryp_SPc结构域,具有催化三联体结构位点His72-Asp118-Ser215和6个保守的半胱氨酸形成3个二硫键(57-73,184-200,211-235)。应用氨基酸序列够建进化树进行系统进化分析发现,青岛文昌鱼胰蛋白酶与同属于原索动物门的海鞘胰蛋白酶聚为一枝,与脊椎动物的距离较远,这与文昌鱼为头索动物的进化地位一致。
其次,为了研究BiTRY的功能,我们构建了原核表达载体,导入E.Coli并诱导表达。BjTRY在包涵体中大量表达。对重组蛋白BjTRY纯化后,进行透析复性。复性后蛋白可以降解胰蛋白酶特异性底物苯甲酰精氨酸乙酯(BAEE),用该底物对酶活进行了测定,得到复性后的重组蛋白活性为375 BAEE U／mg。此外,用不同的蛋白酶抑制剂对重组蛋白BiTRY对BAEE的酶活抑制性进行了测定,发现专一性抑制胰蛋白酶的大豆胰蛋白酶抑制剂和专一性抑制丝氨酸蛋白酶的PMSF对该酶有抑制作用。进一步说明重组蛋白为丝氨酸蛋白酶家族的弹性蛋白酶。
最后,我们研究了Bjtry基因在文昌鱼中的组织和胚胎发育中的时空表达情况。Northern Blot和成体文昌鱼切片原位杂交表明,Bjtry在成体组织肝盲囊和中肠中表达量最高,具有组织特异性。胚胎原位杂交显示,Bjtry在文昌鱼胚胎期无特异性表达,2天幼虫开始在消化道部位能检测到其mRNA的表达,而此部位正是将来肝盲囊和中肠形成的部位。在脊椎动物中胰蛋白酶主要由胰脏分泌,而本研究表明文昌鱼胰蛋白酶主要在肝盲囊和中肠表达,推测文昌鱼肝盲囊和中肠与脊椎动物胰脏可能具有同源性。
文昌鱼;胰蛋白酶;进化地位;基因鉴定
中国海洋大学
硕士
海洋生物学
张士璀
2011
中文
Q556.9;Q959.287
98
2011-10-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）