单环刺螠纤溶酶UFEⅠ的酶学性质和初步药效学及安全性评价
血栓栓塞性疾病(thrombotic disease,TD)是严重危害公众健康的常见病与多发病,主要危害心、脑,肺等血管系统,具有较高的发病率、致残率和致死率。目前,药物溶栓是临床应用上主要的治疗手段。虽然溶栓剂已经发展了三代,但仍然存在诸多副作用,如特异性降解纤维蛋白能力低,易诱发机体出血等。因此,寻找和开发更为安全有效的新型溶栓剂是治疗血栓性疾病的重要内容。
本实验室经过多年对海洋无脊椎动物单环刺螠(Urchis unicinctus)的探索研究,得到一种分子量为26 kDa的纤溶酶,并对其溶栓活性进行了研究,报道了该酶具有直接降解血栓纤维蛋白的能力,溶栓效果优于蚓激酶。本文将对分离纯化得到的新组分UFEⅠ进行研究,进一步丰富对单环刺蝣体内活性物质的相关认识。主要研究结果如下:
1.酶组分UFEⅠ经SDS-PAGE电泳呈单一条带,测定其相对分子质量约为45kDa；IEF电泳图谱测定其pI值为4.58。
2.UFEⅠ酶学性质研究:最适反应温度为50℃,最适反应pH为8.5；酶活力在50℃以下范围内具有良好的热稳定性,在pH7.0-9.0内相对稳定；Mn2+和Fe3+是该酶的抑制剂,EDTA可以强烈抑制该酶的活力；纤维蛋白原为UFEⅠ的最适作用底物；米氏常数Km=1.02 mg／mL,最大反应速率Vmax=34.5μg／min·mL。
3.UFEⅠ具有直接纤溶活性和激酶活性。以纤维蛋白平板法,参照尿激酶标准品,测得该酶的总纤溶活力为每mg酶含302.9个尿激酶活力单位,其中激酶活性为每mg酶含177.6个尿激酶活力单位,约占酶总纤溶活力的41.4％。
4.体外抗凝指标的检测初步推断UFEⅠ的体外抗凝血作用于内凝血途径和共同凝血途径,并可降低纤维蛋白原含量,抑制血栓的形成；体外定量溶栓实验表明,UFEⅠ具有体外直接溶解纤维蛋白的能力。
5.根据对UFEⅠ降解纤维蛋白原产物分析,发现该酶可以迅速降解γ链,随后于4 h完全降解β链,推测UFEⅠ为γ-纤溶酶。
6.UFEⅠ对小鼠体内凝血时间的影响表明,该酶能够显著延长小鼠体内凝血时间,具有抗凝血作用。大鼠颈动脉血栓实验表明,UFEⅠ具有显著延长大鼠体内血栓形成时间的作用,并通过影响内源性凝血途径和血小板的聚集,及其较强的纤溶活力发挥抗凝作用,抑制血栓的形成。
7.溶血性实验、急性毒性实验显示,UFEⅠ不引起机体出现任何溶血反应,不会造成机体出现出血倾向,无急性毒性。
8.UFEⅠ的免疫原性研究显示,该酶可使机体产生微量抗体,刺激动物体内启动体液免疫,提高机体的整体免疫水平,并表现出一过性,但对动物机能不造成负面影响,不属于毒素蛋白。
综上所述,UFEⅠ具有显著的抗凝血和抗血栓形成作用,对动物机体无溶血、急性毒性和低免疫原性,因此,UFEⅠ具有潜在的应用开发价值。
单环刺螠;纤溶酶;酶学性质;抗凝作用;药效学;安全性评价
中国海洋大学
硕士
海洋生物学
刘万顺
2011
中文
R282.77;R965.3
80
2011-10-31（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）