普鲁兰类酵母G7b菌株β-甘露聚糖酶的研究
β-甘露聚糖酶是一类能够水解甘露聚糖主链上的β-1,4-甘露糖苷键的半纤维素酶类。微生物来源的β-甘露聚糖酶具有活性高,成本低,提取方便的优点,而且具有更宽的作用pH,温度范围和底物专一性等显著特点,在食品、医药、饲料、造纸、印染和石油开采等领域中得到了广泛的应用。
本文从实验室已知的17株具有β-甘露聚糖酶活力的海洋酵母菌株中,筛选出自中国南海表层海水的酵母菌G7b菌株所产β-甘露聚糖酶活力最高。通过传统的酵母菌种鉴定及分子生物学鉴定,最终鉴定该株海洋酵母菌属于普鲁兰类酵母(Aureobasidiumpullulans)。酵母菌G7b菌株所产β-甘露聚糖酶粗酶液最适反应pH为5.0,最适反应温度为60℃。通过对其发酵培养基优化,其最适产酶培养基和条件为:角豆胶0.6％(w/v);酵母粉0.5％(w/v),(NH4)2SO40.5％(w/v),KH2PO40.2％(w/v);海水配制,培养基起始pH调至6.0。在28℃,180rpm震荡培养48h,其培养上清液所含β-甘露聚糖酶活力最高,达到10.5U/ml。用粗酶液水解底物,产物为少量甘露糖单糖和甘露低聚糖。
为进一步研究β-甘露聚糖酶,我们对酵母G7b菌株产的β-甘露聚糖酶进行了纯化,并对纯化酶的性质进行了研究。通过SephradexTMG-75凝胶过滤层析和DEAESepharoseFastFlow阴离子交换层析方法对其所产β-甘露聚糖酶进行纯化,通过SDS-PAGE检测其分子量大约为66kDa,获得单一的目的条带。最终纯酶与原样品相比,纯化倍数为1.86倍,回收率为17.2％。Β-甘露聚糖酶最适作用pH5.0,在pH5.0-7.0范围内稳定,最适作用温度60℃,在低于50℃酶的稳定性较好。环境中的Mg2+和Zn2+对酶有一定激活作用,而Hg2+、Mn2+和Cu2+对酶有抑制作用,尤其是Hg2+和Mn2+对酶有强烈的抑制作用。所有的蛋白抑制剂对β-甘露聚糖酶都有一定的抑制作用,其中SDS的抑制作用最为明显。Β-甘露聚糖酶对底物角豆胶的动力学常数Km值和最大反应速度Vmax分别是2945.1μg/ml和27.9μmol/(min*ml,)。该酶水解底物角豆胶,通过薄层层析分析,其产物主要为甘露低聚糖和少量单糖,说明其具有β-1,4-甘露聚糖内切酶活性,能够随机水解甘露聚糖内部的β-1,4-甘露糖苷键,证实该酶为β-1,4-甘露聚糖酶。
中国海洋大学
硕士
动物学
池振明
2009
中文
TQ925
2011-06-30（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）