大菱鲆基因克隆及真核表达研究
大菱鲆是我国重要的海水养殖鱼类，但是随着养殖环境的恶化，鱼病不断发生，不但造成了巨大的经济损失，而且严重影响了该产业的健康发展。目前，虽然针对大菱鲆养殖环境、病原以及养殖技术等方面开展了大量的研究工作，提出了许多防病治病的措施，并取得了一定的成效。但由于引起养殖大菱鲆病害的病原和发病原因的多样性，大量使用抗菌素和农药后造成病原微生物抗药性的提高以及对环境造成的严重破坏，大菱鲆养殖业要摆脱病害的困扰，必须开辟新的疾病防治途径。
抗菌肽是一类具有广谱抗菌活性的小分子物质，是生物体天然免疫反应系统的重要成员，在生物体抵抗外界病原物感染过程中起着非常重要的作用。海水养殖鱼类抗菌肽重组表达为海水鱼类抗病分子育种和疾病控制提供了一条新的途径。而且，胰岛素样生长因子-Ⅰ(insulin-like growth factor-1，IGF-Ⅰ)是一种具有促进多种细胞生长功能的活性多肽，它对组织细胞的增殖、分化、凋亡，机体的生长发育及肿瘤的发生发展起重要的调节作用。同时，在毕赤酵母里表达抗菌肽的研究为开发转基因酵母作为鱼类饵料添加剂的应用研究提供了理论基础。鉴于三者的优势，我们开展了以下研究工作：
1．克隆了大菱鲆IGF-Ⅰ基因。通过荧光实时定量PCR检测表明：IGF-Ⅰ普遍存在于各组织中，但表达量不同，在肝脏中最高；对大菱鲆胚胎发育早期研究表明，随着发育的延续直到孵化期，IGF-Ⅰ基因的表达量呈逐渐增加的趋势；高温刺激研究表明，高温对IGF-Ⅰ基因在肝脏中的表达整体上有抑制作用；饥饿处理显示，饥饿16天已促使IGF-Ⅰ基因在肝脏中的表达水平显著下降。
2．通过基因重组技术构建了5种酵母分泌融合表达载体和5种酵母胞内融合表达载体。western blot检测表明，获得了了四种酵母分泌重组表达菌株，pPICZαA-HIP、pPICZαA-HGP、pPICZαA-HP和pPICZαA-IP。并且随着诱导时间的延长，pPICZαA-HIP和pPICZαA-HGP表达蛋白量逐渐增高，然而在前9个小时未检测到目的蛋白表达。抑菌实验表明：pPICZαA-HIP、pPICZαA-HGP和pPICZαA-HP都有一定的抑菌活性；pPICZαA-HP的抑菌活性最高。通过GFP荧光检测发现，在重组酵母菌组pPICZαA-HGP内和胞外都能检测到融合蛋白的荧光信号。
3．构建了5种荧光蛋白融合细胞表达载体，eGFP-HN，eGFP-IN，eGFP-HN，eGFP-GN和eGFP-MN。转染了大菱鲆肾脏细胞系，在eGFP-HIN，eGFP-GN和eGFP-MN转染细胞系中检测到GFP荧光信号。研究发现，这些荧光信号在这些转基因细胞系中分布不同。
本研究克隆了IGF-Ⅰ基因，研究了IGF-Ⅰ的表达特性；获得了几种SMD1168重组菌株；建立大菱鲆酵母重组表达体系；获得了3种转基因细胞系。为以后开展基因功能活性研究、基因互作、新型饲料添加剂的开发等工作奠定了基础。
大菱鲆;基因克隆;真核表达;海水养殖鱼类
中国海洋大学
博士
生物化学与分子生物学
杨官品;陈松林
2009
中文
S967;Q785
126
2009-10-19（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）