海分枝杆菌培养及致病性研究
海分枝杆菌(Mycobacterium marinum，M．marinum)为一种腐生性非典型分枝杆菌，其分布遍及世界各国，它存在于海水、淡水中，为接触感染。随着对海洋的开发利用，人、鱼共患的疾病存在潜在的危险性，目前已有许多关于海分枝杆菌对人类感染的病例报道。海水养殖人员、海洋捕捞人员、渔民以及观赏鱼养殖人员等，感染的几会明显增加。本文从感染的病变组织中分离到分枝杆菌菌株，通过对其培养和药物敏感试验、再次感染斑马鱼和实验鼠以及分离细菌致病性蛋白的实验，进行致病机理的研究。
(1)分枝杆菌的分离试验：从人感染的脓液组织中，分离培养出的分枝杆菌(R1)，以及从活体的蟹体表分离到的分枝杆菌(Y10)，分别与标准海分枝杆菌菌株进行对照研究发现，培养菌落的对光反应，即产生黄色反应菌落、对9种药物的敏感性试验结果、抗酸染色特性、化学反应特性，以及构成菌株壁蛋白质的分子量大小均表现出一致性，说明这三种分枝杆菌菌株的基因来源有共性。
(2)斑马鱼的感染试验：选择健康的幼斑马鱼60条，随机选取30条，每10条为一组，分别给予腹腔内注射0.1 mL，液体的Y10、R1和标准海分枝杆菌菌液，分别放置于28℃恒温的水箱中养殖，观察斑马鱼的生存情况。腹腔内注射0.1 mL海分枝杆菌菌液，30条斑马鱼相继在7天内死亡。从死亡的斑马鱼尸体上可以看到受感染的病变组织，病变组织变成暗棕红色，打开腹腔可以看到坏死组织，从病变组织中已经分离、培养到海分枝杆菌的致病菌株。
(3)小鼠和大鼠的感染模型建立：分别选取12只健康鼠，随机分成实验组和对照组。根据感染途径的不同，实验组又分成实验组A、B和实验组C。实验组A：经鼠的尾静脉注射分枝杆菌菌液；实验组B：经鼠的腹腔注射分枝杆菌菌液；实验组C经消化道感染。对照组鼠给予经尾静脉注射同等剂量的生理盐水做对照。感染第1周后，重复感染一次，第8周采取其尾静脉血分别进行细胞因子(白细胞介素、干扰素-gamma和肿瘤坏死因子-alpha)、免疫球蛋白(IgA、IgG和IgM)、C-反应蛋白和补体(C3和C4)的检测。细胞因子检测采用酶联免疫吸附试验(ELISA)；免疫球蛋白、C-反应蛋白和补体的检测方法采用全自动生化分析仪测定。
海分枝杆菌对昆明鼠有致病性，从尸体解剖病理切片标本中可以看到明显的肉芽肿斑块，肉芽肿包含大量的颗粒状物质，即干酪样坏死物。感染2周后的小鼠外周静脉血中白细胞介素检测结果，实验组A和B小鼠在感染期间血清中白细胞介素IL-2、IL-4、IL-10、IL-12差异无统计学意义(p＞0.05)，与实验组C和对照组小鼠比较有明显的增加，IL-4和IL-10增加的更加明显。IL-2和IL-12与对照组差异有统计学意义(p＜0.05)；IL-4和IL-10与实验组C和对照组差异有统计学意义(p＜0.01)。
大鼠感染第8周后外周静脉血清中，细胞因子检测：感染8周后血清中sIL-2R和IFN-γ的分泌明显的增加，实验组与对照组之间差异有统计学意义(p＜0.05)，实验组A、B和C组之间差异无统计学意义(p＞0.05)；TNF-α在感染8周后尽管分泌有增加的趋势，但实验组和对照组之间差异无统计学意义(p＞0.05)。补体检测：实验组A、B和C组之间，C3、C4、CRP的含量差异无统计学意义(p＞0.05)，实验组A、B和C组与对照组之间的差异有统计学意义(t=3.88-2.58，p＜0.05)。免疫球蛋白检测：实验组A、B和C组之间的差异无统计学意义(p＞0.05)，对照组与实验组之间的差异有统计学意义(p＜0.05)。
(4)分离分枝杆菌菌体蛋白，电泳分离，并进行分析。分离到分子量65kD左右的蛋白抗原，为主要的致病性蛋白。双向电泳实验表明分枝杆菌菌株细胞壁检测到490个蛋白质斑点。分子质量范围均处于10～100kD。蛋白的pI值主要分布于4.5～6.0，其中在pH4.5～5.5之间蛋白分布比较密集，5.5～6.0之间的蛋白点比较稀散，即偏碱性侧的蛋白几乎没有，蛋白主要集中在偏酸性侧。两株分离株和标准海分枝杆菌的致病性蛋白存在同一性。
海分枝杆菌;细胞因子;免疫球蛋白;致病性
中国海洋大学
博士
水生生物学
战文斌
2009
中文
Q939.131
94
2009-10-19（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）