杂合肽PM23的分子设计与表达和从猪血中提取血红素技术的研究
抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMP)是生物界中广泛存在的一类具有抗菌活性的短肽，是天然免疫系统中的重要免疫分子，具有抗菌谱广、活性稳定，不易产生耐药性等优点，在食品、饲料、医药领域具有重要的应用价值。
Pleurocidin是从冬季比目鱼的粘膜中发现的，对革兰氏阴性和阳性菌具有广谱抗性作用的小肽。Misgurin是从泥鳅中分离出来的、具有抗细菌和真菌活性而无溶血活性的抗菌肽。本实验以Pleurocidin和Misgurin为基础，依据抗菌肽结构与活性的关系，利用生物信息学工具计算了杂合肽的物化参数并预测了其二级结构；其中杂合肽Pleurocidin(1-8)-Misgurin(7-21)，简称PM23，为α-螺旋抗菌肽，具有较强的正离子性和两亲性，是晟具潜力的杂合肽。根据所设计的PM23分子序列，并参考大肠杆菌偏爱密码子，用化学合成法合成了PM23基因，同时在序列的两端引入双酶切位点，将该基因定向插入带有相同酶切位点的融合表达载体pGEX-4T-2中，构建了重组表达质粒pGEX-4T-2-PM23；将pGEX-4T-2-PM23转化大肠杆菌BL21，菌落PCR筛选阳性克隆，DNA测序验证插入序列；使用IPTG诱导融合蛋白表达，SDS-PAGE电泳和蛋白免疫印迹检测表达产物；表达产物经亲和层析纯化后，进行肠激酶切割和抗菌活性检测。菌落PCR和DNA测序证实了PM23基因已被正确地插入pGEX-4T-2载体中；经IPTG诱导4h后，受体菌中融合蛋白的表达量达到峰值，此时约占总蛋白量的20％；所表达的融合蛋白的分子量约为29KD，具有抑制大肠杆菌的活性；酶切结果表明，融合蛋白中含有分子量约为3KD的杂合肽PM23。
本研究为抗菌肽的生产提供了一条重要的途径，并为进一步研究抗菌肽的生产表达、结构与功能和设计新型的抗菌肽药物奠定了基础。
血红素是细胞蛋白的组成部分，具有多种生物学功能和广泛的应用价值。利用猪血制备氯化血红素能够变废为宝，同时防止废弃血液直接排放可能带来的环境危害，因此具有重大的环保意义和经济价值。本文选用超声波破碎法和丙酮蒸馏法相结合的方式从猪血中制备氯化血红素。
为研究超声波破碎红细胞的最佳条件，采用正交试验法，以血红蛋白含量为指标，研究了去离子水添加量、超声波功率和超声破碎时间对血红蛋白浓度的影响。血红蛋白含量的测定采用碱羚高铁血红素(AHD-575)法进行。结果表明，去离子水加入量为红细胞体积的1/5、超声波功率250W和破碎时间10min是超声波破碎红细胞的最佳条件。
为了提高丙酮蒸馏法制备氯化血红素的收率和获得高纯度的氯化血红素，研究了不同的pH值、抽提时间、搅拌速率和丙酮添加量等工艺参数对氯化血红素的收率和纯度的影响。试验结果表明，5倍体积的丙酮溶液加入量、pH2.0、500rpm搅拌10min是丙酮蒸馏法制备氯化血红素的最佳工艺条件；在此工艺条件下，氯化血红素的收率为92.5％、纯度为93.4％。
抗菌肽;分子设计;杂合肽PM23;原核表达;抗菌活性;氯化血红素;丙酮蒸馏法
中国海洋大学
硕士
细胞生物学
胡国斌
2009
中文
TQ464.56
60
2009-10-19（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）