青岛文昌鱼transferrin-like基因的克隆、表达和功能研究
转铁蛋白是一种非血红素结合的β-球蛋白，它具有两个铁离子(Fe3+)结合位点，可以结合两个铁离子。多个物种转铁蛋白的结构、功能、序列和表达已有了深入的研究。但是，关于文昌鱼转铁蛋白的研究却未见报道。文昌鱼是无脊椎动物进化到脊椎动物的过渡类群的典型代表，一直被认为是研究脊椎动物起源和进化的模式动物。本文从青岛文昌鱼(Branchiostoma belcheri)消化道cDNA文库中，分离到一段具有完整3’末端的transferrin-like基因(BbTfl)，然后对该基因序列进行了克隆，并对其结构、鉴定、表达和功能进行了研究。
首先，我们从头索动物文昌鱼中克隆出类转铁蛋白基因(BbTfl)并对其序列进行了分析。其最大开放阅读框编码1256个氨基酸的蛋白质(理论分子量为148kDa)，含有一个N末端的信号肽，属于分泌型蛋白。该cDNA编码的蛋白BbTfl，其N-端和C-端具有保守的transferrin结构域。但其C-端结构域有一个巨大的插入片段，这与脊椎动物及无脊椎动物中的转铁蛋白都不同，但是与已报道的海胆的主要卵黄蛋白(MYP)极为相似，均属于转铁蛋白家族。将BbTfl完整的N-端结构域同其他Tfs进行序列比对发现，该蛋白与各物种中Tfs的同源性较低，但是12个半胱氨酸残基的位置很保守，说明他们可能具有相似的三级结构。系统进化分析发现，包括文昌鱼BbTfl在内的无脊椎动物Tfs聚为一个类群，脊椎动物的Tfs聚为一个类群，且文昌鱼BbTfl位于脊椎动物Tfs的基部。
其次，我们对transferrin-like基因在青岛文昌鱼中的表达情况做了研究。Northern blot结果显示，BbTfl基因在青岛文昌鱼的肝盲囊和后肠中的转录产物为一条带，大小为4100bp左右，与我们从文昌鱼中克隆的BbTfl cDNA的大小基本一致。切片原位杂交分析表明，BbTfl在成体文昌鱼组织中呈特异性表达，在肝盲囊和后肠中的表达量最高。用革兰氏阴性菌感染文昌鱼后，肠中BbTfl基因表达水平在12和24小时显著升高。因此，推测文昌鱼BbTfl可能是一种急性时相蛋白，参与宿主免疫防御。
为了在蛋白水平上验证文昌鱼BbTfl是否参与宿主免疫，我们构建原核表达载体，表达并纯化出重组蛋白BbTflN，复性后对其功能进行检测，检测到复性后的BbTflN具有螯合铁离子活性及抗菌活性。抗菌活性的检测发现它对革兰氏阴性细菌大肠杆菌和革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌都有显著的抑制作用，这说明BbTfl是一种免疫相关蛋白，可以抑制革兰氏阳性菌如金黄色葡萄球菌和革兰氏阴性菌如大肠杆菌的生长。而当抗菌实验中有铁离子加入时，这种抑制作用便会减弱，因此，Tf的铁离子结合能力似乎对于其发挥抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的活性是必不可少的。综上，我们认为文昌鱼transferrin-like蛋白与宿主的免疫防御有关，推测是因其螯合铁离子使细菌失去其生长繁殖所必须的营养因子而抑制其生长。
文昌鱼;transferrin-like基因;基因克隆;基因表达;抗菌活性
中国海洋大学
硕士
细胞生物学
张士璀
2009
中文
Q785;Q959.287
86
2009-10-19（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）