青岛文昌鱼弹性蛋白酶基因的鉴定、表达分析和功能研究
弹性蛋白酶(Elastase，Elas)是丝氨酸蛋白酶家族的一员，以水解不溶性弹性硬蛋白(Elastin)为特征，具有广泛的水解蛋白活性。已在包括无脊椎动物和脊椎动物的很多物种中被鉴定，但是在文昌鱼中对于此类蛋白功能却了解甚少。文昌鱼是现存的与脊椎动物原始祖先最接近的头索动物，一直被认为是研究脊椎动物起源和进化的模式动物。本文从青岛文昌鱼(Branchiostomabelcheri)cDNA文库中，分离出具有完整编码框的Elas基因(BbElas)，并对其结构、进化、表达和功能进行了研究。
首先，从文昌鱼cDNA文库中克隆到全长为987 bp的BbElas cDNA，其最大开放阅读框编码277个氨基酸的蛋白质，理论分子量为29 kDa，经分析发现该蛋白质有一长为16个氨基酸的信号肽。该cDNA编码的蛋白(BbElas)同脊椎动物的ELAS一样，在氨基酸序列的31-267位具有一个完整的Tryp SPc结构域，具有高度保守的GDSGGPL序列和催化三联体结构位点His74-Asp127-Ser222，并且在氨基酸序列的59位、75位、161位、191位、207位、218位、228位和248位具有8个相当保守的半胱氨酸。将BbElas同其他物种ELAS蛋白构建进化树进行系统进化分析发现，BbElas与无脊椎动物的ELAS聚为一支，且位于脊椎动物ELAS的根部，进一步表明了文昌鱼在进化上的地位。
其次，我们还研究了ELAS基因在文昌鱼中的表达情况。Northern Blotting和切片原位杂交表明，BbElas在成体组织中肠中的表达量较高，具有组织特异性。
为了研究BbElas的功能，我们构建原核表达载体，导入E．Coli诱导表达。BbElas在包涵体中大量表达；经透析复性后，纯化出重组蛋白BbElas。用重组蛋白作用于弹性蛋白酶特异性底物N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide，发现它能够降解该底物，用该底物对酶活进行了测定，得到复性后的重组蛋白活性为0.22±0.02 U/mg。此外，我们用不同的蛋白酶抑制剂对重组蛋白BbElas对N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanil-ide的酶活抑制性进行了测定，发现专一性抑制丝氨酸蛋白酶的PMSF和专一性抑制弹性蛋白酶的Elastitanal对该酶有强抑制性。进一步说明重组蛋白为丝氨酸蛋白酶家族的弹性蛋白酶。
文昌鱼;弹性蛋白酶;基因表达;基因鉴定
中国海洋大学
硕士
细胞生物学
张士璀
2009
中文
Q786;Q959.287
73
2009-10-19（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）