利用抑制性消减杂交(SSH)技术研究鳗弧菌不同毒力菌株的基因多样性
鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是一种引起鱼类弧菌病的重要的条件性致病菌，在世界各地流行，能感染八十余种海洋及河口鱼类，也是我国海水养殖的花鲈、牙鲆、大菱鲆等动物的重要病原菌，常给水产养殖业造成较大的危害，因此对该菌毒力相关因子的研究对于其防治具有重要的意义。目前已发现的鳗弧菌毒力因子主要有金属蛋白酶(metalloprotease)、铁载体(siderophore)及外膜蛋白(outermembrane protein，OMP)等。然而，总体来说对鳗弧菌众多毒力因子的研究大多数集中在强毒株上，而对弱毒株或无毒株的报道极少，这就为毒力因子的鉴定带来了困难。而且强毒株、弱毒株和无毒株之间的毒力差异不能用目前这些已知因子的有无加以解释，因而推测有其它因子导致其毒力差异。
遗传关系密切而又具有一定生物学特征差异的两种或两株细菌的比较基因组学研究受到普遍重视，因为在某一菌株存在而在另一菌株缺失的基因可能具有很重要的分子生物学意义。抑制性消减杂交技术(suppression subtractivehybridization，SSH)是抑制性PCR和消减杂交技术相结合的简单快速的分离筛选差异基因的方法。它利用强毒株作为检测子(tester)，弱毒株或无毒株作为驱动子(driver)，将强毒株与弱毒株基因组一致的大量冗余部分去除，提炼出更具有研究价值的信息。消减杂交通过对强毒株及弱毒株的差异显示使研究方向更具针对性，消减杂交的片段可以作为候选的毒力相关因子的标志，让我们距离事实真相更近一步，具有简单易行、特异性高、能分离出低丰度差异片段等优点。
两株鳗弧菌菌株VIB72和CW1对斑马鱼(Brachydanio rerio)存在明显的毒力差异(菌株VIB72的LD50=4.17×103 cfu/per fish；菌株CW1的LD50=2.14×106 cfu/per fish)。本研究从两株鳗弧菌菌株的毒力差异出发，采用抑制性差减杂交技术构建特异性的DNA差减文库，将消减文库中特异表达的DNA片段插入载体，转化大肠杆菌，扩增文库后，经蓝白斑和抗生素初步筛选，随机挑取白色克隆进行菌落PCR分析插入片段，通过菌落PCR从384个随机挑选的差减文库克隆中筛选出187个阳性克隆，占总数的48％。经过斑点杂交进一步筛选出59个差减克隆的插入片断，这些片段只存在于菌株VIB72中而在菌株CW1中缺失，并对成功测序的55个片断进行同源性分析，这55个片断中有30个(约占55％)与已知蛋白或假定蛋白的编码基因有序列同源性，其中17个与已知蛋白的编码基因有序列同源性。
这些已知蛋白有：可溶性溶胞壁质转糖基酶、转移蛋白MobA和MobC、转座酶IS66、抗性相关蛋白(金属β－内酰胺酶和乙酰转移酶家族)、毒素蛋白(DT－201和alveicin A免疫蛋白)、与OLD家族相似的ATP依赖性核酸内切酶以及SocE和GTP结合蛋白HflX(有高频率的溶原化)，这些蛋白中绝大多数在其他细菌中有一定的毒力作用，但在鳗弧菌中还是第一次被发现。由此可以推断，这些基因片断有可能是鳗弧菌毒力岛的一部分，其完整基因编码的蛋白因子极有可能在鳗弧菌致病过程中能发挥巨大作用。这些片断的发现为进一步研究该菌的致病机理奠定了良好的基础。此差减文库的构建将减少克隆鳗弧菌毒力相关基因的盲目性。本研究发现的潜在毒力基因片段，可借助染色体步移等技术，克隆出其完整的毒力基因，为进一步研究该菌的致病机理奠定良好的基础。同时以上毒力基因片段亦可用于鳗弧菌毒力菌株和非毒力菌株的鉴别。
鳗弧菌;抑制性消减杂交;遗传差异;毒力基因;基因多样性
中国海洋大学
硕士
海洋生物学
张晓华
2009
中文
S941.91
66
2009-09-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）