海洋细菌Cellulophaga sp.QY201的内切葡聚糖酶研究
纤维素是D－葡萄糖以β－1，4－糖苷键组成的线性大分子，它是植物细胞壁的主要组成成分并且是自然界中含量最高的多糖类物质。纤维素应用广泛，特别是作为可再生的碳源和能源，已成为基础和应用研究的热点。纤维素酶是一类能够将纤维素降解为葡萄糖的多组分酶系的总称，属于糖苷水解酶，传统上被分为3类组分：内切葡聚糖酶(endo－1，4－β－D－glucanase，EG，EC3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(exo－1，4－β－D－glucanase，EC3.2.1.91)、β－葡萄糖苷酶(β－1，4－D－glueosidase，EC3.2.1.21)。这三种酶协同作用，分解纤维素产生寡糖和纤维二糖，最终水解产物为葡萄糖。纤维素酶的研究不仅在糖生物学领域具有重要理论意义，而且纤维素酶降解纤维素较传统的理化方法经济、有效，在纺织、日用化工、食品发酵、畜牧饲料等领域都有广泛的应用。
本文利用硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析技术，从海洋细菌Cellulophaga sp.QY201发酵液上清中分离纯化到一种内切葡聚糖酶，命名为CelA。其比活力为59.8 U/mg，纯化倍数为33.2倍，回收率为3.2％，SDS－PAGE显示为单一条带，分子量为35.0 kDa。酶学性质研究表明，其最适反应温度和pH分别为50℃和pH6.0；该酶在0－40℃之间和pH4.0一6.6范围内稳定；在0℃，CelA仍保持最大酶活的50％－55％；将其在40℃保存3小时后，活力几乎没有丧失，24小时后仍保持酶活的88％；Na+、K+、Ni2+能促进酶活性，Cu2+、Mg2+、Fe2+、Ba2+、Zn2+、Ca2+、Fe3+、SDS能抑制酶的活性，但很多离子对其作用并不明显；将CelA在蛋白酶K终浓度为0.1mg/mL的体系中于37℃温浴30min，仍保存酶活的95％。底物特异性分析结果表明，该酶主要降解CMCNa，对whatman滤纸、木聚糖、微晶纤维素有微弱的降解作用，对CMC、水杨素、淀粉无降解作用；TLC分析其最小降解底物为纤维四糖，降解纤维寡糖的产物主要为纤维二糖和纤维三糖，还伴有少量的葡萄糖产生。
为了克隆celA基因，我们对纯化的野生酶进行了氨基酸测序，根据其N－端和中间3段肽段的氨基酸序列设计简并引物，利用简并PCR和反向PCR从海洋细菌Cellulophaga sp.QY201.的基因组DNA中克隆到Cel.A的编码基因celA。分析表明其开放阅读框为1080bp，编码359个氨基酸，理论分子量为40.799 kDa，N－端存在一个51个氨基酸组成的信号肽序列；推测其成熟蛋白由308个氨基酸组成，理论分子量和等电点分别为35.08kDa和5.0，其理论分子量与野生酶的SDS－PAGE结果完全一致；氨基酸序列分析发现其属于糖苷水解酶家族5。将celA基因连入pET24a(+)表达载体，并在E.coli BL21(DE3)表达菌株中进行了表达。将菌体离心后溶于20mmolpH=4.6的Na2HPO4－柠檬酸缓冲液，超声破碎后，Ni离子亲和层析分离纯化重组酶。SDS－PAGE分析结果表明，纯化后的酶为单一条带，达到电泳纯，其分子量约为36kDa，与理论分子量一致。重组酶的酶学性质与野生酶基本一致。
综上所述，本论文从海洋细菌Cellulophaga sp.QY201的发酵液上清中分离到一种中性内切葡聚糖酶CelA，该酶在0℃仍具有活性，且温度稳定性好；利用多种PCR技术克隆了其编码基因，并在大肠杆菌中实现了高效表达。该酶的发现不仅丰富了纤维素酶的多样性，而且有望用于纺织行业和日用化工行业，具有重要的理论意义和广泛应用前景。
内切葡聚糖酶;分离纯化;基因克隆;基因表达
中国海洋大学
硕士
海洋生物学
于文功
2009
中文
Q936
81
2009-09-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）