海产品过敏原免疫芯片检测方法的研究
海产品及其制品是联合国粮农组织提出的主要过敏原之一，海产品过敏问题越来越受到人们广泛的关注。由于极微量的过敏原就能导致严重的过敏反应，探索有效的海产品过敏原检测方法，有助于提高海产品的食用安全性。
本论文以主要海产品过敏原为研究对象，选择南美白对虾(Penaeus Vannamei)、杂色蛤(Ruditapes philippinarum)、鲅鱼(Scomberomorus niphonius)等常见水产品为代表，进行过敏原的提取及纯化，采用蛋白质芯片技术建立了过敏原检测的技术体系。主要从南美白对虾、杂色蛤、鲅鱼等主要过敏原的分离纯化、抗体制备、三维蛋白芯片制备、过敏原检测生物探针的制备、芯片检测条件的优化等方面进行研究，得到如下结论：
1.优化了硫酸铵沉淀法分离纯化过敏原的方法，通过向一定浓度、pH值的硫酸铵溶液中加入海产品粗提蛋白的方式，提高硫酸铵沉淀过敏原的准确性，并通过电泳切胶回收得到纯度为95％以上的海产品过敏原蛋白。
2.确定并优化了三维蛋白质芯片的制备条件。分别采用原子力显微镜和X-射线光电子能谱对修饰后的芯片表面进行物理和化学表征，结果表明使用3％氨基硅烷修饰玻片、0.1mol/mL NaIO4活化琼脂糖芯片表面能够形成均匀的三维网格结构，表面衍生的活性醛基有助于改善亲水性能及形成三维化凝胶表面，提高生物分子的固定效果。
3.利用纯化后的南美白对虾、杂色蛤、鲅鱼主要过敏原蛋白免疫新西兰大白兔获得了高效价的多克隆抗体，三种海产品过敏原蛋白抗血清的效价分别为1.5×106、2.0×106和1.0×106。获得南美白对虾、杂色蛤、鲅鱼的鼠源单克隆抗体，共得到9株单克隆抗体。经过亚型的鉴定，本研究发现鲅鱼单抗的3株单克隆抗体均为IgG1类型，而杂色蛤的3株单克隆抗体中，只有一株为IgG1类型，另外两株分别为IgA和IgM类型，南美白对虾的2株单克隆抗体均为IgG1类型。对获得的单克隆抗体进行生物素标记，制备了灵敏的海产品过敏原检测探针。
4.通过响应面的方法分别确定了蛋白芯片法检测南美白对虾、杂色蛤、鲅鱼等三种过敏原的最佳反应条件。确定南美白对虾过敏原检测限为20ng/mL，线性检测范围为20.0ng/mL～20.Oμg/mL；杂色蛤过敏原检测限为40ng/mL，线性检测范围为40.0ng/mL～40.0μg/mL。鲅鱼过敏原检测限为20ng/mL，线性检测范围为20.0ng/mL～20.0μg/mL。
5.测定海产品过敏原检测芯片性能，结果表明批内和批间变异系数(CV％)均在5％-10％之间。不同过敏原检测系统之间不发生交叉反应。南美白对虾、鲅鱼、杂色蛤三种过敏原在馒头中的平均回收率都在75％左右：而鲅鱼和南美白对虾过敏原在牛奶中的回收率达到90％以上，杂色蛤过敏原在牛奶中的回收率略低，也达到80％以上。
目前针对海产品过敏原检测的方法主要集中在酶联免疫等传统的检测方法上，采用免疫芯片对海产品过敏原进行检测的方法尚未见报道。本研究结合过敏原检测的特点，首次对三维芯片载体的基片进行处理，得到了具有良好固定效果的三维芯片载体，并在此基础上，建立并完善了海产品过敏原的检测方法。这将为海产品过敏原的控制提供必要的技术储备。
海产品过敏;过敏原;免疫芯片检测方法
中国海洋大学
硕士
食品科学
林洪
2009
中文
R446.61;R155.5
105
2009-09-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）