抗WSSV囊膜蛋白单抗的中和效果研究
本论文利用抗WSSV蛋白VP28、VP26、VP19的单克隆抗体杂交瘤细胞生产腹水并进行了提纯；利用酶联免疫吸附法(ELISA)和克氏原螯虾(Cambarusproclarkii)检测了单抗在不同病毒浓度下以及单抗两两混合的中和效果，结果表明MAb1D6(VP28)随病毒浓度的降低，体内中和效果越明显；同时提取了VP28、VP26、VP19三种蛋白并通过双向电泳对囊膜蛋白VP28进行初步分析。具体研究结果如下：
(1) WSSV的提纯及抗WSSV囊膜蛋白单克隆抗体的生产：使用差速离心和蔗糖密度梯度离心法提纯WSSV。复苏了本实验室制备的1D6、2G3、3G7、2E9等4株单克隆抗体杂交瘤细胞，通过生产腹水得到了足量的抗体并对其进行提纯。经间接免疫荧光检测，四株抗体与感染WSSV的虾鳃均呈特异性反应。经Western-Blot检测，1D6、2G3能与WSSV蛋白VP28反应，3G7能与WSSV蛋白VP26反应，2E9能与WSSV蛋白VP19反应。
(2)不同病毒浓度下WSSV单抗的体内中和实验：通过酶联免疫吸附法测定不同稀释度的WSSV与已制备的WSSV襄膜蛋白单克隆抗体1D6及2E9结合的OD值。结果显示，在1×10-3病毒稀释度下两种单抗均足量。利用克氏原螯虾动物模型，将不同稀释度病毒与单抗1:1混合孵育2h后，肌肉注射克氏原螯虾(50μL/只)，观察记录螯虾的死亡情况。结果显示当病毒浓度为1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6稀释度时，MAb1D6(VP28)螯虾组最终死亡率分别为100％、90％、16.7％、6.7％，而MAb2E9(VP19)螯虾组最终死亡率分别为100％、100％、100％、93.3％。这表明随病毒浓度的降低，MAb1D6(VP28)的中和效果越明显。而MAb2E9(VP19)并无明显的中和效果。在螯虾中和实验中，除阴性对照组、MAb1D6(VP28)的1×10-5、1×10-6病毒稀释度组之外，死亡螯虾经间接免疫荧光检测均呈WSSV感染阳性。
(3) WSSV混合单抗的中和实验：提取中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)血细胞膜并对WSSV进行地高辛标记，将单抗两两混合后与病毒作用，吸附对虾血细胞膜，使用抗地高辛抗体检测结合到血细胞膜上的病毒。结果显示混合前后OD值无明显变化，因此不能证明四株单抗之间具有协同作用。利用克氏原螯虾动物模型，将MAb1D6(VP28)与另外三株抗体分别混合，将混合液与WSSV粗提液1:1混合孵育2h后，肌肉注射克氏原螯虾(50μL/只)，观察记录螯虾的死亡情况。结果显示单抗混合之后螯虾的累积死亡率与MAb1D6(VP28)螯虾组的累积死亡率无显著差异，因此不能证明MAblD6(VP28)与其他三株抗体之间具有协同作用。
(4) WSSV囊膜蛋白VP28的初步分析：通过对病毒进行SDS-PAGE，切胶分离病毒蛋白，并洗脱提纯，获得了VP28，VP26及VP19三种蛋白。经Western-blot检测，所提取的VP28蛋白与MAb1D6以及MAb2G3均呈阳性反应。将VP28进行双向电泳，图谱显示，Blue Silver染色法染色之后的胶体，只有一个蛋白点可见，其等电点在5.8左右，因此VP28蛋白可能由单一的蛋白构成。
对虾白斑症病毒;囊膜蛋白;单克隆抗体
中国海洋大学
硕士
水产养殖
战文斌
2009
中文
S945.46
67
2009-09-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）