大菱鲆红体病虹彩病毒基因组全序列测定和分析及其在海水养殖鱼类中无症状感染的PCR分析
虹彩病毒(iridovirus)是一类感染变温脊椎动物和无脊椎动物的二十面体状、大型细胞质DNA病毒，是水产养殖动物和野生动物重要的病毒性病原。大菱鲆红体病虹彩病毒(turbot reddish body iridovirus，TRBIV)是新发现的感染中国和韩国养殖大菱鲆的鱼类虹彩病毒，是工厂化养殖大菱鲆最主要的病毒性病原之一。本文应用PCR扩增、DNA克隆、大规模测序与生物信息学等方法，测定并分析了TRBIV的全基因组序列。结果显示，TRBIV基因组为双链线状DNA，全长为110，104 bp，G+C含量为54.99％。全基因组中含有115个可能的开放阅读框(open reading frame，ORF)，编码长度介于40到1168个氨基酸残基的多肽。全部ORF覆盖了TRBIV基因组92％的区域，其中56.5％为正向编码，43.5％为反向编码。TRBIV的115个ORFs中有39个ORFs与传染性脾肾坏死病毒(Infectious spleen and kidney necrosis virus，ISKNV)、条石鲷虹彩病毒(rock bream iridovirus，RBIV)、褐点石斑鱼虹彩病毒(Orange-spotted grouperiridovirus，OSGIV)的已知功能的ORF有高度的相似性，相似度分别为76-99％，87-99％，75-99％。这些蛋白大致可以分为以下几类：DNA复制相关，转录和核酸代谢相关，蛋白修饰相关，宿主相关，膜相关等等。TRBIV基因组中散布着许多重复序列，包括正向重复序列、反向重复序列和回文序列，其中绝大部分为正向重复，并与ISKNV、真鲷虹彩病毒(red sea bream iridovirus，RSIV)、OSGIV的重复序列高度相似。采用TRBIV的主要结构和功能蛋白如主要衣壳蛋白(major capsid protein，MCP)、腺苷三磷酸酶(adenosine triphosphatease，ATPase)、DNA聚合酶(DNApolymerase，DdDp)、核苷酸还原酶小亚基(ribonucleotide reductase，small chain，RNRS)，胞嘧啶DNA甲基转移酶(Cytosine-C5-specific DNA methylase，DMet)的氨基酸序列构建了虹彩病毒系统进化树，在分子水平上研究了TRBIV的系统进化，结果表明TRBIV属于虹彩病毒科肿大细胞病毒属。TRBIV全基因组序列的测定为诊断和防治水产动物虹彩病毒病提供分子生物学的基础资料和理论依据，为水产养殖动物虹彩病毒病的防治开辟途径。
将TRBIV全基因组序列分别与肿大细胞虹彩病毒属中的ISKNV，OSGIV，RBIV的核苷酸序列进行比对，寻找TRBIV与它们在序列上的差异区，差异区即为肿大细胞虹彩病毒属内不同株型之间的变异区，即TRBIV最可能的潜在的变异区。选取差异较大的5处变异区，在变异区的两端设计正反引物对4株不同地方不同年代的TRBIV进行PCR扩增。测序结果表明4株不同地方不同年代的TRBIV在这5处地方不存在任何差异。
研究建立了一种检测TRBIV的套式PCR方法，用该方法对不同稀释倍数的重组质粒pMD18-TRBIV ATPase为模板进行PCR扩增，结果显示所建立的套式PCR的灵敏度大约为一步PCR的104倍。用建立的套式PCR方法对我国常见海水养殖鱼类进行TRBIV流行病学调查，发现一步PCR检测为阴性的宽体舌鳎，半滑舌鳎，黑裙，非洲石斑鱼等4种鱼类，经套式PCR扩增出长度为471bp的特异性的DNA片段，将该片段PCR产物测序。用NCBI-Blast软件将测序结果在GenBank中进行搜寻、比较，结果发现与注册号为AY608684.1的TRBIV ATPase基因序列的一部分片段有100％的同源性，说明半滑舌鳎、宽体舌鳎、黑鲳、非洲石斑鱼等四种海水养殖鱼类体内存在TRBIV的无症状感染，它们可能也是TRBIV的宿主。
虹彩病毒;海水养殖鱼类;大菱鲆;全基因组
中国海洋大学
硕士
水产养殖
史成银;孔晓瑜
2009
中文
S941.41
80
2009-09-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）