水产品中恩诺沙星残留一步式酶联免疫快速检测方法的研究
恩诺沙星(Enrofloxacin)是一种化学合成的广谱抗菌药物，是氟喹诺酮类药物的代表产品，广泛应用于养殖、临床等各个领域。该类药物的耐药性、残留毒性以及不良反应等的报道越来越多。世界许多国家都针对该类药物制定了动物性食品中的最大残留限量标准。恩诺沙星的检测一般采用色谱法作为确证性检测方法；近年来快速筛选检测的免疫分析方法引起越来越多的关注。
本研究旨在建立水产品中恩诺沙星残留的一步式ELISA快速检测方法，以进一步提高快速筛选检测效率。通过对传统两步式间接竞争ELISA竞争反应模式、反应时间、洗涤时间等主要因素的优化改进，建立了恩诺沙星一步式间接竞争ELISA检测体系；利用不同的偶联方法，建立并优化了恩诺沙星酶标抗体的合成方法，并以所制备的酶标抗体为基础建立了标记抗体型一步式直接竞争ELISA检测模式，并进行了加标水产样品的检测验证。主要实验结果如下：
1.间接竞争ELISA中，采用平衡饱和模式，在竞争反应中比较理想的竞争反应物添加顺序是酶标二抗——待测抗原——特异性抗体，在适当提高抗体浓度的前提下，可以将传统两步式简化为一步式，检测时间由总的4h以上，缩减到2h左右。对水产样品在10μg/kg～200μg/kg的加标范围内，检测的平均回收率可达到70％以上，相对标准偏差低于15％。此外，不同聚合度(PEG4000、6000、20000)、浓度(1％-9％)的聚乙二醇作为反应加速剂对恩诺沙星间接竞争ELISA检测的加速作用不显著。
2.首次采用过碘酸钠氧化法合成酶标恩诺沙星抗体，根据紫外扫描结果计算出酶标抗体的克分子比为1.6，酶结合量为1.2 mg/mL、酶结合率约为40％，均处于较好的质量范围内；ELISA效价测定结果表明，酶标抗体的效价达到10000×以上，工作效价在1000×左右，标记前后抗体亲和活性保持良好；所制备的酶标恩诺沙星抗体对于主要同族药物的交叉反应率均低于1％。
3.采用N-琥珀酰胺-3-(2-吡啶二硫)丙酸酯(SPDP)和硫酸化-琥珀酰胺-4-[N-马来酰胺甲基]-环己烷-羧酸酯(Sulfo-SMCC)两种异型双功能交联剂(可分别提供为6.8A和8.3A空间臂长)交联制备酶标抗体，所设定的HRP和IgG的用量、DTT作用的pH体系、交联剂对蛋白的作用pH体系等影响因素的实验结果表明，交联剂对蛋白作用的pH体系对交联结果的影响显著；两种交联剂比较，空间臂较长的Sulfo-SMCC的性能略好。
4.利用高碘酸钠法所制备的恩诺沙星酶标记抗体，建立了标记抗体型一步式直接竞争ELISA(Dc-ELISA)。根据所用抗体种类及纯化方式的不同，方法的最低检测限可以达到5μg/kg-10μg/kg，在设定的10μg/kg-40μg/kg的加标浓度下，检测的平均回收率可达到70％，批内相对标准偏差在10％以下。
5.标记抗体型一步式直接竞争ELISA检测方法应用于在水产样品检测的HPLC验证结果表明，Dc-ELISA和HPLC方法呈现较好的相关性(R2可以达到0.95以上)，且一步式Dc-ELISA检测方法所需时间仅为2h左右，样品前处理纯化的要求低，操作较为简便，适合大量样品的快速处理。
目前，针对食品中氟喹诺酮类残留的免疫检测方法的报道多集中在间接竞争ELISA检测方面，对于直接竞争ELISA模式涉及的较少，标记抗体型的直接竞争ELISA检测研究，尚未见报道。本研究首次合成了酶标记恩诺沙星抗体，并在此基础上建立了具有良好灵敏度、准确性和精密度的一步式直接竞争ELISA检测技术。这将为水产品中恩诺沙星残留的快速监测提供更加有效的技术工具。
恩诺沙星;广谱抗菌药物;色谱法;免疫快速检测
中国海洋大学
硕士
水产品加工与贮藏工程
林洪
2009
中文
TS254.7
57
2009-09-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）