以细菌群体感应为靶标的抑制因子筛选
随着抗菌药物的广泛应用，细菌的耐药性已成为全球关注的重大难题。目前临床上使用的抗生素都是通过直接杀死微生物或抑制微生物生长来实现抗感染的目的，在这种生存压力下，细菌很容易产生耐药性。显然以传统的靶点和筛选方法获得的抗生素无法从根本上解决细菌的耐药问题，因此，寻找治疗细菌感染的新途径已成为当今研究的前沿和热点。近年来，细菌群体感应(quorum sensing，QS)研究的发展，给我们带来了新的机遇和挑战。研究表明缺失了群体感应系统的菌株其致病能力大大降低，因此筛选高效的群体感应抑制剂有望成为解决细菌耐药问题一个有效途径。以细菌的群体感应系统为靶标筛得的抗菌药物，与传统的抗生素的作用机制完全不同，只抑制细菌群体感应调控的致病行为，不影响细菌的生长，因此，理论上细菌不会产生耐药性。本文以铜绿假单胞菌的las群体感应系统为靶标，建立筛选模型，从化合物库和海洋微生物中筛选群体感应抑制因子(quorum sensing inhibitor，QSI)。
利用铜绿假单胞菌las群体感应系统调节的lasB基因启动子，与报告基因gfp(绿色荧光蛋白基因)或SacB(蔗糖致死基因)，构建融合质粒pW-1和pW-4，转入群体感应系统缺失突变株PAO-MW1中，建立两种高灵敏度群体感应抑制因子筛选模型PAO-MWlpW-1和PAO-MWlpW-4；模型PAO-MWlpW-1在0.5μM3-O-C12-HSL存在下，通过荧光酶标仪检测GFP表达情况来筛选QSI；模型PAO-MWlpW-4可用平板法直接可视化筛选，在0.2μM3-O-C12-HSL、0.2μMC4-HSL和6％的蔗糖存在时细胞致死，当有QSI同时存在时细胞可被补救。为提高模型PAO-MWlpW-4的灵敏性，建立了一种高灵敏度的TTC活菌染色方法，在PAO-MWlpW-4筛选平板中加0.05％(w/v)的TTC，活菌代谢TTC会产生红色甲瓒，而死菌不着色。
从胶州湾海泥分离海洋真菌、放线菌，小体积发酵制备粗提物，用建立的铜绿假单胞菌群体感应抑制因子筛选模型及已有的紫色杆菌筛选模型进行初步筛选，得3株真菌提取物具铜绿假单胞菌群体感应抑制活性，1株放线菌提取物具紫色杆菌群体感应抑制活性，且在有效浓度范围内对细菌生长没有影响。经16SrDNA初步鉴定该放线菌为Streptomyces属。进一步研究表明，该提取物能够显著降低紫色杆菌受群体感应调节的紫色菌素产量和相关蛋白酶的表达量，且呈浓度依赖性。
利用建立的筛选模型对已有的化合物库进行筛选，发现法尼醇能够有效抑制铜绿假单胞菌las群体感应系统；在PAOlpqsA-突变体中试验表明该抑制作用与PQS系统无关；通过计算机模拟分析、回补试验证明法尼醇能够和3-O-C12-HSL信号分子竞争lasR蛋白的结合位点，从而抑制las系统调控的lasB、toxA等毒力相关基因和swarming行为等。通过对法尼醇类似物活性分析表明法尼醇的疏水长链上双键的立体构象和侧链甲基是必要的。
综上所述，本文建立两个高效的铜绿假单胞菌群体感应抑制抑制因子筛选模型；并从海洋微生物提取物中发现了3株真菌提取物具铜绿假单胞菌群体感应抑制活性和1株放线菌提取物具紫色杆菌群体感应抑制活性；从化合物库中发现法尼醇能够有效抑制铜绿假单胞菌las群体感应系统，并对其作用机理进行研究。以上工作对新型抗菌药物的研究和开发具有重要意义。
抗菌药物;细菌群体感应;抑制因子筛选
中国海洋大学
硕士
生药学
于文功
2009
中文
R378.99
91
2009-09-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）