细菌荧光素酶-NADH：FMN氧化还原酶体系与IMS联用进行水产品致病菌的快速检测
致病菌污染可导致多种食源性疾病的发生，严重危害人类健康，是影响食品安全的首要因素。研究和发展新型、快速、灵敏、特异的致病菌检测技术，己成为保证食品安全的关键。本论文基于生物发光的原理，借助于免疫磁珠分选(IMS)技术平台，建立了适用于水产品致病菌检测的细菌荧光素酶-NADH：FMN氧化还原酶体系。该双酶体系通过检测细菌胞内NADH达到检测致病菌数量的目的。应用该体系对水产品中单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌进行了快速识别检测。
第一、本论文对细菌荧光素酶-NADH: FMN氧化还原酶体系进行了优化，建立了适合测定NADH含量的双酶体系。应用该体系检测NADH具有高灵敏性，NADH的检测限为1×10-10 mol/L，远高于传统方法——紫外法和荧光法NADH检测限(1x10-5mol/L，1×10-8mol/L)。
第二、选用免疫磁珠分选作为样品的前处理方法，可以解决细菌荧光素酶-NADH:FMN氧化还原酶体外发光体系无法对不同菌种胞内NADH进行特异识别的问题，从而达到特异检测目的菌的目的。本论文评价了商品化Dynabeads anti-Listeria和Dynabeads anti-Salmonella对致病菌免疫分选效果，确定了免疫磁珠分选法的检测限——单增李斯特菌的检测限为4×102cfu/mL、鼠伤寒沙门氏菌的检测限为5cfu/mL；分析了免疫磁珠的特异性，研究了竞争菌对免疫磁珠分选目的菌的影响；对被高浓度致病菌污染(目的菌)的样品进行免疫磁珠分选；通过改变磁珠工作体积(由20μL优化为60μL)提高了目的菌与免疫磁珠的结合率，以满足双酶体系检测致病菌菌数的灵敏性要求。
自行制备了霍乱弧菌免疫磁珠，并进行了性能分析。为利用细菌荧光素酶-NADH：FMN氧化还原酶体系检测水产品中更多种类致病菌打下基础。
第三、对细菌胞内NADH的提取作了探讨，确定热Tris-HCl法作为菌体胞内NADH的提取方法。利用双酶体系对单增李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌进行测定，确定两种菌单位菌体胞内NADH含量分别为2.38×10-17mol/cell，2.78×10-16mol/cell，为今后的定量生物发光传感器打好基础。
第四、细菌荧光素酶-NADH：FMN氧化还原酶体系与IMS联用对纯培养和水产品样品中的单增李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌进行检测。两种致病菌的菌数在108～1010cfu/mL(g)间与双酶体系的发光强度呈一定的线性关系。在不增菌的情况下，整个检测过程在1h内完成，检测限为108cfu/ml(g)。体系的灵敏性有待进—步的提高。
第五、对单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌的前增菌做了初步研究，以提高双酶体系灵敏性。选择EB增菌液及亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC)分别对单增李斯特菌和鼠伤寒沙门氏菌进行增菌，得到以下结论：EB增菌液对非单增李斯特菌有强烈的抑制作用，单增李斯特菌污染量为1 cfu/g的样品经过32h培养可满足双酶体系的灵敏性；鼠伤寒沙门氏菌污染量为1 cfu/g的样品经过12 h培养也可满足双酶体系的灵敏性。在增菌的情况下，34h、14h内可完成单增李斯特菌、鼠伤寒沙门氏菌的检测，检测限均为1cfu/g样品。
总之，本论文建立的细菌荧光素酶-NADH: FMN氧化还原酶双酶与IMS联用检测体系是—种特异，灵敏，简便，高效，易操作的快速检测方法。
水产品;致病菌;氧化还原酶体系;细菌荧光素酶;IMS联用;快速检测;致病菌检测
中国海洋大学
硕士
水产品加工与贮藏工程
林洪
2009
中文
TS207.4;TS254.7
96
2009-09-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）