单环刺螠纤溶酶的分离纯化及其药效学研究
血栓栓塞性疾病一直以来严重危害着人类的健康，不仅发病率高，而且死亡率和致残率也很高，它主要危害心、脑，肺等血管系统，造成人死亡或者偏瘫残疾。全世界每年新增1500万血栓性病人，在我国每年约有200多万人死于心脑血管疾病，急需溶栓治疗的病人超过500万。因此，血栓性疾病药物研发已经成为当今全世界医学界研究的重点。
应用溶栓剂进行溶栓治疗是当前治疗血栓性疾病的主要手段。虽然溶栓剂已发展了三代，但仍有诸多的副作用，如特异性降解纤维蛋白能力低，易诱发机体出血等。因此，寻找和开发新型溶栓剂仍是治疗血栓性疾病的重要内容。鉴于海洋生物活性物质自身其独特的优点，海洋生物逐渐成为新药研发的珍贵资源。本实验室经多年研究，从海洋无脊椎动物单环刺螠(Urchis unicinctus)中寻找和分离出了一种新型纤溶酶，命名为单环刺螠纤溶酶(UFE)，并对其酶学性质和药效学活性展开相关研究，现将主要研究结果简述如下：
1.单环刺螠体腔液经分子量8，000Da截留超滤，Sephadex G-75，DEAE-52和Sephacryl S-100柱层析分离，获得酶组分经HPLC分析其纯度为95％，SDS-PAGE电泳图谱呈单一蛋白条带。SDS-PAGE法测其相对分子质量约为26kDa。酶纯化倍数为10.2，回收率为13.9％。
2.对此酶进行相关酶学性质的研究，结果表明UFE的最适反应温度为50℃，最适反应pH为8.0；酶活力在pH6.0-9.0时相对稳定；在20℃-50℃温度范围内，具有良好的热稳定性。Mg2+对酶的活性有促进作用，Cu2+、Fe3+. Ca2+、Zn2+、Fe2+、Ba2+等离子对酶活性均具有一定的抑制作用。以酪蛋白为底物，根据双倒数作图法，求得该酶的米氏常数Km=2.2mg/mL为，最大反应速率Vmax=41.15μg/min·mL。
3.UFE具有直接纤溶活性和激酶活性的双重纤溶能力。以尿激酶标准品为参照，琼脂糖纤维蛋白平板法标定UFE的总活力效价为每mg酶含2477.2个尿激酶活力单位，其中激酶活性为每mg酶含1605.6个尿激酶活力单位，约占酶总活力的64.8％。
4.溶血性实验，皮下出血实验，全身过敏实验证实，该酶具有良好的生物安全性。急性毒性实验验证UFE的半致死剂量LD50为571.36mg/kg，95％的可信限为531.83—623.21mg/kg，无毒性。
5.根据UFE降解纤维蛋白原产物分析，推测其为γ-纤溶酶。
6.体外溶栓实验表明，UFE组3h时血栓溶解率达76.3％，与蚓激酶对照组有显著性差异(p<0.01)，具有直接溶解纤维蛋白的能力。
7. UFE可显著延长APTT，PT，CT和TT值，具有明显的抗凝效应，但其抗凝效应不作用于抑制血小板聚集这一环节。体内颈动脉血栓各指标实验表明，UFE可使ELT时间显著缩短，纤维蛋白降解产物FDP含量增多，D-二聚体反应呈阳性，说明UFE使机体继发性纤溶途径明显增强，提高了机体整体的纤溶活力。
综上所述，UFE具有显著的抗凝活性和纤溶活性，具有重要的临床开发价值，值得深入研究。
单环刺螠纤溶酶;分离纯化;血栓栓塞性疾病;海洋生物;抗凝活性;溶栓活性
中国海洋大学
硕士
海洋生物学
刘万顺
2009
中文
R282.77;R284.2
78
2009-09-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）