大菱鲆(Scophthalmus maximus)4种免疫或生长相关因子的原核表达及活性分析
本论文以重要的海水养殖经济鱼大菱鲆为实验材料，采用分子克隆与体外重组技术，对影响鱼类生长和抗病的重要基因胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、抗菌肽hepcidin与IGF-I的重组基因hep-IGF、CXC趋化因子S457和CC趋化因子KC70进行了克隆和原核表达的研究，并采用不同的活性测定法对几种蛋白表达产物进行了活性研究。
1.大菱鲆胰岛素样生长因子-I的克隆、原核表达及促生长活性分析
通过RT-PCR方法从大菱鲆肝组织克隆了胰岛素样生长因子-I(IGF-I)成熟肽片段，分析表明此成熟肽由70个氨基酸残基组成，含有3个链内二硫键。经序列比对，发现大菱鲆IGF-I是高度保守的蛋白，其成熟肽的氨基酸序列与牙鲆、金鲈、草鱼、鸡、人的相似性分别为100％、98％、86％、79％、76％。将扩增片段克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上，实现了IGF-I成熟肽和GST蛋白在E.coli BL21(DE3)plysS中的的融合表达。融合蛋白分子量约为34kD，诱导4h时占菌体总蛋白的59％，主要以包涵体形式存在。Western-blotting免疫印迹表明融合蛋白可以特异性地被anti-GST抗体识别。对菌体进行超声破碎，收集包涵体并用1％Triton-X100+1％DOC洗涤，经6mol/L盐酸胍变性溶解及脉冲法稀释复性(0.5 mol/L L-Arginine，1.0 mol/L GSH，0.2 mol/LGSSG.)后，通过GSTrap FF亲和预装柱纯化，获得了电泳分析纯的融合蛋白。以细胞增殖实验检测蛋白生物活性，结果显示纯化蛋白能促进大菱鲆肾脏细胞的增殖。
2.大菱鲆融合蛋白hepcidin-IGF的重组表达及活性分析
以实验室构建的pMD-hep-IGF质粒为模板进行PCR，在片段上添加EcoR I和Xho I酶切位点。经过酶切、连接和转化，将扩增的hep-IGF片段克隆至pGEX-4T-1重组表达载体，并转化E.coli BL21(DE3)plysS宿主菌。阳性重组克隆用IPTG进行不同时间的诱导，结果表明hep-IGF重组蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达。随着诱导时间的增加，重组蛋白的表达量增加，在诱导后7h时达最大，大约占大肠杆菌总蛋白的55％。western-blotting免疫印迹表明，重组菌所表达的融合蛋白可以特异性地被anti-GST抗体识别。对菌体进行超声破碎，收集上清过GSTrap FF亲和柱，获得了纯化的GST-hep-IGF重组蛋白。用液体抑制法验证hep-IGF融合蛋白的抑菌活性，结果表明大肠杆菌(ATCC25922)培养8h后，加重组蛋白的处理组与不加任何样品的处理组相比出现抑制效果。
3.大菱鲆趋化因子S457和KC70的原核表达及趋化活性分析
以大菱鲆肝脏cDNA为模板进行PCR，获得了S457和KC70成熟肽片段。序列比对发现这两种趋化因子与其他物种的CXC或CC趋化因子的相似性不高：大菱鲆S457与斑马鱼CXCL-C1c、鼠CXC L7、猪CXC L9、人CXC L5相似性分别为34％、39％、42％、39％；大菱鲆KC70与大黄鱼CC样趋化因子、大西洋鲑CCL19、斑马鱼CCL-C5a、鸡CCL19、人CCL19相似性分别为61％、39％、35％、45％、38％。将扩增片段克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上，实现了融合表达。GST-S457融合蛋白分子量约为38.6kD，诱导4h时表达量最大，占菌体总蛋白的47.5％；GST-KC70融合蛋白分子量约为36.1kD，诱导4h时表达量最大，占菌体总蛋白的45.6％。Western-blotting免疫印迹表明融合蛋白可以特异性地被anti-GST抗体识别。对菌体进行超声破碎，收集上清过GSTrap FF亲和柱，纯化的蛋白进行趋化活性分析。结果显示当GST-S457重组蛋白浓度为0.1和1ug/mL时，与对照组相比具有显著差异(P<0.01)，且后者趋化作用更明显；当GST-KC70重组蛋白浓度为10ug/mL时，与对照组相比具有显著差异(P<0.01)。
海水养殖;大菱鲆;分子克隆;胰岛素样生长因子-I;基因克隆;原核表达;趋化因子
中国海洋大学
硕士
海洋生物学
陈松林
2009
中文
Q784;S965.399
79
2009-09-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）