栉孔扇贝(Chlamys farreri)心肌组织细胞培养的初步研究
海水贝类具较高的经济价值，其养殖已成为我国海水养殖业的支柱产业。近年来，海水养殖贝类大规模死亡事件频繁发生，急需建立稳定的贝类细胞培养体系，从细胞和分子水平研究病原体及其致病机理，从而有效检测、预防疾病的发生。细胞培养便于开展细胞工程育种技术，培育出抗逆能力强的新品种，也是解决病害防治的手段之一。贝类种质资源丰富，其细胞系的建立将有助于遗传资源的长期保存。此外，随着环境污染的加剧，贝类作为敏感生物的指示作用也日益凸显。本研究以我国北方沿海重要水产养殖贝类栉孔扇贝为研究对象，进行细胞培养的研究，旨在建立一套栉孔扇贝组织细胞体外长期培养方法，为免疫学研究、病原体侵染机制研究、物种保护、遗传育种、环境监测等搭建平台，并最终为栉孔扇贝细胞系的建立构建基础。
栉孔扇贝心肌组织原代培养单因子条件优化结果显示，基本培养基L-15能够最大化促进植块细胞迁出及较长时间维持细胞体外存活，L-15+M199次之，M199效果较差；5％FBS能够最大化促进植块细胞迁出及较长时间维持细胞体外存活，10％FBS次之，15％及20％FBS效果较差。在基本培养基L-15、5-10％FBS培养条件下，细胞平均存活2周左右，部分细胞可维持50d。体外培养的心肌细胞具活跃的收缩现象，细胞单层处可形成肌管及肌丝结构。超微结构显示培养10 d后的心肌细胞中肌原纤维局部存在，培养更长时间的心肌细胞中肌浆网膨大为若干空泡。随着培养，细胞琥珀酸脱氢酶活性逐渐减弱，而碱性磷酸酶活性相对稳定。
以L-15为基本培养基，添加不同浓度的FBS、牛磺酸、Ca2+，正交实验结果显示，5％FBS利于植块细胞迁出，血清浓度越高，细胞迁出效果越差。5％FBS与各浓度牛磺酸组合可以显著延长细胞存活时间1-2周；高浓度牛磺酸(50 mM)效果更加显著，细胞存活较低浓度牛磺酸(5mM、20mM)组延长10-30 d左右，部分心肌细胞可以维持正常生长状态达60 d以上。20％FBS与各浓度牛磺酸组合的实验组中，多数细胞存活2周左右，部分心肌细胞可存活1个月左右，且这些细胞多表现为体积增大，胞质中含有大量的颗粒；在该类组合的高浓度牛磺酸(50mM)实验组中，部分细胞具较高的琥珀酸脱氢酶活性，观察到疑似部分分裂末期细胞，以及发育早期细胞的增殖现象，但随着培养细胞逐渐分化，最终出现空泡而退化，培养共维持41d。
本文首次利用慢病毒表达载体介导的方法，尝试将SV40LT导入栉孔扇贝原代培养第3d心肌细胞，感染后10 d左右未观察到明显的细胞增殖。SV40LT转导栉孔扇贝心肌组织原代培养细胞各种实验条件仍需进一步优化。
栉孔扇贝;心肌组织;细胞培养;慢病毒表达载体
中国海洋大学
硕士
细胞生物学
张志峰
2009
中文
S944.43
90
2009-09-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）