养殖大菱鲆几种重要细菌性疾病病原菌的鉴定及其病原学初步研究
大菱鲆(Scophthalmus maximus)是欧洲名贵海水鱼种，原产于英国，隶属于鲆科。它具有适应低水温生活，生长速度快，肉质好，养殖和市场潜力大等优点，相继成为欧洲各国开发的优良海水养殖鱼类之一。我国于1992年由黄海水产研究所首先引进国内，在苗种驯化、亲鱼培育、人工育苗、工厂化养殖以及人工配和饲料方面取得重大技术突破后，已经在我国沿海地区形成了大规模的工厂化养殖，成为我国第四次海水养殖浪潮的支柱性产业，为我国北方沿海的工厂化养鱼向纵深发展奠定了雄厚的基础，取得了良好的经济和社会效益。然而随着养殖规模的不断扩大，疾病的发生已越来越频繁，尤其是细菌性疾病，已成为制约这一产业可持续健康发展的限制性因素，给养殖户带来了巨大的经济损失。为了保证大菱鲆养殖业健康稳定的发展，积极开展细菌性疾病病原的鉴定和病原学的研究是对疾病进行综合防治必不可少的基础性工作。
本论文主要目的是对几种养殖大菱鲆细菌性疾病的病原菌进行鉴定及其病原学的初步研究。
2007年8-9月份某一大菱鲆养殖场患有红体病，患病大菱鲆主要症状为病鱼的皮下肌肉充血发红，有腹水，鳃贫血，感染后漂浮于水面，内部解剖发现其肝脏颜色正常，肾、脾中等肿大，肠壁变薄，充水。感染率几乎达到100％。从患病的鱼体体中分离出一株优势菌命名为H1，为革兰氏阴性，呈杆状，具有周生鞭毛，ID32E鉴定结果显示该菌为迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella. tarda)，相似率达到99.9％，进一步对其16SrDNA序列进行分析和系统发育树的构建，结果显示H1菌与E.tarda自然聚类，亲缘关系最近。综合以上结果可将H1菌鉴定为E.tarda。用该菌感染健康大菱鲆，能够引起正常大菱鲆患红体病，且感染症状与自然状态下发病症状基本一致，其半致死量为2.82×105CFU/ml，从被人工感染患红体病的大菱鲆鱼体中再次分离得到的细菌，经ID32E鉴定也亦显示为迟钝爱德华氏菌(E.tarda)。故将此病病原确定为迟钝爱德华氏菌。根据细菌的16SrDNA的16S rDNA3'端和23S rDNA5'端的高度保守区设计引物，扩增了一株大菱鲆细菌性红体病病原菌迟钝爱德华氏菌的16S-23S rDNA间区，克隆到pMD18-T载体上，测序。以迟钝爱德华氏菌的16S-23S rDNA IGS为靶区设计了一对特异性引物，建立了一种新的迟钝爱德华氏菌的PCR检测方法，此方法可快速、灵敏的检测出红体病的主要致病菌。
2008年在调查中还发现，有一种由迟钝爱德华氏菌引起的疾病时有发生，其症状是病鱼体色发黑，眼周围组织有轻微浮肿。内部解剖发现，肝脏已经萎缩，且肝脏内有大量的积水现象，鳃绝大多数充血，也有个别贫血现象，有些鳃的顶部已经溃烂。由病鱼体中分离出一株优势菌并命名为E-1，经革兰氏染色为阴性菌，杆状。ID32E生理生化试剂条自动兼人工鉴定结果为迟钝爱德华菌，相似性为99.9％，所以初步认为此种病是由一株爱德华氏菌引起的。在分子水平上测定了其16s rRNA基因序列，分析并建立了系统发育树，与迟钝爱德华菌聚为一支，所以将此株菌鉴定为迟钝爱德华菌(E.tarda)。其半致死浓度为1.35×105CFU/ml。
患鼓眼病的病鱼单眼或双眼凸起，其眼眶周围组织充血、浮肿呈现淡红色，随着病情的进一步发展，鱼眼会发生暴裂、出血；病鱼上颌部发生肿大，充血发红；鳃盖区域也往往伴有充血发红现象，严重者会出现多处出血斑；病鱼有腹水现象。病鱼表现为慢性死亡。从患有鼓眼病的大菱鲆体中处分离到的一株病原菌G1，革兰氏染色为阳性，在油镜下观察为球形状。综合该菌在形态、生理生化、ID32E和API20NE试剂条鉴定结果、16SrDNA同源性等方面的特征，确定为酪黄肠球菌(Enterococcus casseliflavus)。
患白斑病的大菱鲆主要症状是棘刺变浊白，棘刺周围的组织也开始被感染，形成白斑，有的白斑连成一片。主要感染体重在0.25公斤以上的大菱鲆，4个月左右达到感染后期，数天内病症蔓延较快，此时死亡率达到100％。在几次的细菌分离中，共得到五株优势菌株B1、B2、B3、B4和B5，经过16S rDNA序列的测定分别鉴定为枯草芽孢杆菌、嗜冷雪杆菌，红平红球菌、嗜冷雪杆菌和埃希氏假交替单胞菌。经人工回接感染预实验证明只有B1(枯草芽孢杆菌)和B3(红平红球菌)能够导致大菱鲆发病，初步判定此病系有枯草芽孢杆菌和红平红球菌感染所引起。
大菱鲆;细菌性疾病;红体病;鼓眼病;白斑病;迟钝爱德华氏菌;酪黄肠球菌
中国海洋大学
硕士
遗传学
张晓华;王印庚
2009
中文
S943.399;S941.42
79
2009-09-28（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）