蛋白酶抑制剂的制备及其抑制狭鳕鱼糜凝胶劣化的研究
鱼糜是一种经粉碎和漂洗后，主要由可溶性肌原纤维蛋白组成的鱼肉制品。鱼糜中残留的蛋白酶可引起鱼糜凝胶结构的破坏，从而导致鱼糜制品品质及商业价值的下降。蛋白酶抑制剂可用于抑制鱼糜凝胶的降解。本研究选取鲑鱼的卵和血浆作为原材料以提取蛋白酶抑制剂。通过酸处理、超滤浓缩和木瓜蛋白酶亲和柱纯化，从鲑鱼卵中纯化出了一种cysmtin，其纯化回收率、比活力和纯化倍数分别为0.4％、1.54 U/mg和192.6倍。SDS-PAGE检测发现其分子量为13 kDa。氨基酸测序发现其N-末端为N-Gly-Leu-Ile-Gly-Gly-Pro-Met-Asp-Ala-Asn-C，该序列与鲑鱼其它组织中的cystatin的组成完全一致。通过使用木瓜蛋白酶亲和柱，从鲑鱼血浆中纯化出了一种kiniongen，该纯化的回收率、比活力和纯化倍数分别为0.94％、3.84 U/mg和30.36倍。SDS-PAGE与FPLC的检测表明其分子量为70 kDa。抑制活性染色表明，该抑制剂仅在非还原条件下可检出。PAS染色表明该抑制剂属于糖蛋白。
以木瓜蛋白酶作为目标酶，鲑鱼卵cystatin的抑制能力最强；鲑鱼血浆kiniongen的抑制能力高于玻璃鱼卵抑制剂I、池沼公鱼抑制剂和另一种鲑鱼卵抑制剂；以组织蛋白酶L作为目标酶，鲑鱼卵cystatin的抑制能力略低于玻璃鱼卵抑制剂Ⅱ，高于其他抑制剂；鲑鱼血浆kininogen的抑制能力高于狭鳕卵抑制剂、玻璃鱼卵抑制剂Ⅰ和鲑鱼卵抑制剂。鲑鱼卵cysmtin和鲑鱼血浆kininogen具有广范围的酸碱和热稳定性。在pH 5-8的范围内，鲑鱼卵cystaitn的活性几乎无损失。在pH 6-9的范围内，鲑鱼血浆kininogen可保留60％以上的抑制活力。鲑鱼卵cystatin在70°C以下处理30 min，可保留大于50％的活性。鲑鱼血浆kininogen在60°C处理30 min，可保留50％的活性。鲑鱼卵cystatin与鲑鱼血浆kininogen主要在20-50°C的范围内表现出抑制活性。Dixon-plot作图发现，鲑鱼卵cystatin属于竞争性抑制剂，其抑制常数为2.12nM；鲑鱼血浆kininogen属于非竞争性抑制剂，其抑制常数为105.32 nM。
通过合成编码鲑鱼卵cystatin的DNA，采用pYES2NT/C质粒，以啤酒酵母YPH 499为宿主，进行了鲑鱼卵cystatin的重组表达。诱导表达后，分别使用选择性镍亲和柱和乙醇沉淀法进行重组cystatin的纯化，其中亲和纯化的回收率、比活力和纯化倍数分别为61.23％、7.45 U/mg和5.60倍。SDS-PAGE检测发现，重组cystatin的分子量为35 kDa，推测其发生了双体交联。与天然鲑鱼卵cystatin相比，重组cystatin的抑制活力有所下降，在酸性范围内的稳定性也有所下降，但其热稳定性得以增强。采用响应面法进行了摇瓶规模啤酒酵母YPH 499生产重组cystatin的优化研究，发现在培养基pH为5.7，诱导时间为6.7 h，诱导辅助剂的添加量为5.6g/L时，重组cystatin的产量最大，可达0.57U/mL。该研究结果与重复实验结果相一致。在摇瓶优化研究的基础上，进行了发酵罐中搅动速率和通气速率影响啤酒酵母YPH 499生产重组cystatin的优化研究，发现在350 rpm的搅动速率结合1.0 vvm的通气速率的发酵条件下，发酵罐中重组cystatin产量达到最大，为0.56U/mL。该研究结果与重复实验结果相一致。
将纯化的重组cystatin添加到狭鳕鱼糜中，进行了鱼糜凝胶劣化的抑制研究。亲和纯化的重组cystatin，添加量为100 μg/g时，其对鱼糜凝胶劣化的抑制率可达到90％以上。在该添加剂量下，凝胶的破碎力和变形量分别增加了4.5倍和30％。同时，其可榨出水分含量由17.85％减至6.27％，白度由49.78增加至52.60。SDS-PAGE检测表明，通过添加重组cystatin，可显著抑制蛋白酶引起的肌球蛋白的降解。重组cystatin的抑制效果显著强于蛋清粉。醇沉纯化的重组cystatin也可有效抑制鱼糜凝胶劣化，通过添加500μg/g的醇沉重组cystatin，可使凝胶的破碎力和变形量增加2.7倍和10％。因此，可将重组cystatin用于抑制狭鳕鱼糜的凝胶劣化。
蛋白酶抑制剂;鱼糜;凝胶劣化
中国海洋大学
博士
水产品加工与贮藏工程
林洪
2008
中文
TS254.1
92
2008-12-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）