O-GlcNAc修饰在乳腺癌转移过程中的作用及其机制研究
O-GIcNAc是一种广泛存在于蛋白质丝/苏氨酸残基上的一种动态、可逆的蛋白翻译后修饰；与经典的糖基化修饰不同，它主要分布在细胞浆和细胞核中。O-GlcNAc修饰基团的添加和移除分别是由糖基转移酶(O-GIeNActransferase，OGT)和糖苷酶(O-GlcNAcase，OGA)完成的。O-GlcNAe不仅参与了生物体绝大多数正常生理功能的调控，还可能在多种疾病的发病过程中发挥重要的作用，近年来的一些研究已经证明O-GlcNAc的异常与神经退行性疾病、糖尿病和心血管疾病等相关。然而，在O-GlcNAc与肿瘤的研究方面，虽然目前已发现多种与肿瘤相关的蛋白可以被0-GlcNAc修饰(例如p53、c-Mye等)，但是O-GlcNAc与肿瘤的确切关系或者说O-GlcNAc是否参与了肿瘤发生和发展过程还未见报道。因此，本论文对O-GlcNAc与乳腺癌的发生和发展进行了系统的研究，并探讨了O-GlcNAc调节小鼠乳腺癌肺转移的分子机制。
首先，利用慢病毒shRNA表达载体构建了小鼠OGT基因沉默载体，并对小鼠乳腺癌细胞4T1中的OGT表达进行稳定、高效的沉默，从而建立了O-GlcNAc修饰抑制的乳腺癌细胞模型；其次，利用糖苷酶OGN的特异性抑制剂O-(2-acetamido-2-deoxy-d-glucopyranosylidene)amino-N-phenylcarbamate(PUGNAe)处理4T1细胞，从而使细胞中总体O-GlcNAc修饰水平升高。MTT法和细胞计数实验表明，O-GlcNAc不能影响4T1细胞的体外增殖能力；软琼脂克隆形成实验表明，O-GlcNAc对4T1细胞的锚定非依赖性生长能力也没有显著影响；Transwell小室法检测O-GlcNAc对4T1细胞迁移能力的影响，结果表明，OGT的沉默能显著抑制细胞的迁移能力而PUGNAc处理能显著促进细胞的迁移能力。在体外实验的基础上，利用小鼠乳腺癌模型检测了OGT沉默对4T1细胞肿瘤形成能力和转移能力的影响，结果表明，OGT沉默不能影响肿瘤的形成但能显著抑制乳腺癌细胞的肺转移能力。
上述实验结果表明，O-GlcNAc在乳腺癌肺转移过程中发挥重要作用，因此，我们对其作用机制进行了进一步的研究。WB和激光共聚焦实验表明，OGT沉默可以促进E-cadherin的表达和膜分布而PUGNAc处理能抑制E-cadherin的表达和膜分布。免疫沉淀和激光共聚焦实验表明，O-GlcNAc可以抑制E-cadherin和β-catenin、p120的相互作用，这可能是O-GlcNAc抑制E-cadherin的表达和膜分布的分子机制。由于E-eadherin在许多肿瘤的发生和发展过程中发挥重要作用，所以我们推测O-GlcNAe很可能通过调节E-cadherin的表达和膜分布影响乳腺癌细胞的迁移和转移。
利用RNAi技术构建了E-cadherin基因沉默细胞模型和OGT/E-cadherin双基因沉默细胞模型。细胞迁移实验表明，E-cadherin的表达水平与乳腺癌细胞的迁移能力负相关,PUGNAc处理能显著促进对照细胞的迁移而对E-cadherin基因沉默细胞的迁移没有显著影响；E-cadherin的沉默可以回复OGT基因沉默对4T1细胞的迁移抑制作用。这些结果表明，O-GlcNAc可以通过E-cadherin调节乳腺癌细胞的迁移。
ERK1/2信号在许多肿瘤的发生和发展过程中发挥重要作用，实验中我们发现O-GlcNAc可以促进乳腺癌细胞的ERK1/2活性。进一步的实验显示，MAPK通路抑制剂PD98059可以抑制ERK1/2活性和乳腺癌细胞的迁移，这表明O-GlcNAc可能会通过调节ERK1/2活性影响乳腺癌细胞的迁移。
综上所述，本文利用分子生物学和细胞生物学的方法，首次证明了O-GlcNAc在小鼠乳腺癌肺转移过程中的作用，并阐明了促进乳腺癌细胞迁移的分子生物学机制。本文的研究不仅对于阐明乳腺癌转移及其分子机制具有重要的理论意义，而且为乳腺癌的诊断及治疗提供了新的靶点和研究思路。
O-GlcNAc修饰;乳腺癌;转移过程
中国海洋大学
博士
药物化学
于文功
2008
中文
R737.9
116
2008-12-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）