喹诺酮药物族特异性识别材料及其检测性能的研究
食品中农兽药多残留的快速筛选检测，是当前及今后一段时期内食品安全检测领域的研究难点和热点之一。本论文针对目前应用较广泛的喹诺酮类药物，研究了DNA以及抗体两种生物材料对其的亲和识别特征，建立了相关的模拟和预测体系，完成了族特异性识别材料的筛选制备；在此基础上建立了食品中喹诺酮多残留的快速筛选技术，对所制备识别材料的应用性能进行了验证和完善。主要研究结果归纳如下：
(1)首次采用平衡透析方式研究确定了DNA对于喹诺酮类药物的特异性结合作用、关键参数及主要影响因素。研究表明pH以及Mg2+对于DNA-喹诺酮之间的结合具有显著影响，最适pH处于6-7之间，最适Mg2+浓度为0.5-1.0 mM；单链DNA对于恩诺沙星的亲和常数以及结合比约为双链DNA的2倍，而且与恩诺沙星等6种喹诺酮呈现出非常相似的结合性能：亲和常数都处于0.94×105M-1至2.40× 105M-1之间，而结合比在4.1-6.9之间，显示出较为明显的族特异性识别特征；以未经纯化处理的牛奶为食品样本进行了DNA-恩诺沙星结合能力的验证实验，与缓冲液中的结果没有显著差异，证明所采用的DNA对于喹诺酮具有较高的特异性，可以作为族特异性识别材料用于食品分析等。
(2)以单链：DNA为喹诺酮识别材料，发展了表面等离子共振生物(SPR)传感器，并以牛奶为样本对其检测性能进行了验证。研究中利用LbL多层累积手段，以PDDA为配体多聚阳离子建立了DNA-PDDA在传感器芯片表面的共固定化技术，固定化DNA数量与LbL循环反应次数之间存在显著的正相关l生：适量Mg2+的添加以及牛奶提取液对芯片的预处理，可以有效消除非特异性结合等因素对于检测的干扰：在加标牛奶样本中进行的检测显示出较好的特异性，对于恩诺沙星的检测限约为3μgmL-1，批内变异系数＜15％，0-120μgmL-1之间呈现较好的线性关系。
(3)利用Cerius2软件等建立了分子模拟及预测模型，并在此基础上完成了具有较高族结构特征的喹诺酮半抗原的筛选。对喹诺酮分子的空间构象进行模拟和叠合的结果表明，1位取代基和7位是导致不同药物间构象差异的主要因素，1位与邻近位置间的相互作用会对分子的整体构象产生影响；首次建立了分子空间结构相似度的计算与预测模型，拟合验证表明，结构相似度与抗体交叉反应率之间存在较显著的线性相关性(R=O.7852，P<0.0001)，证明该定量模拟模型具有较高的准确度；分子模拟结果表明，培氟沙星、恩诺沙星以及环丙沙星甲基化修饰物具有较高的族内结构相似度。
(4)分别制备了培氟沙星和环丙沙星甲基化衍生物抗体，测定表明它们均具有较好的族内识别能力，与前期的分子模拟及预测结果能够较好吻合，其中培氟沙星抗体对所选用10种喹诺酮药物中的9种具有25％以上的交叉反应率，对其中6种的交叉反应率基本达到70％以上。
(5)利用培氟沙星抗体为族特异性识别材料，分别建立了ELISA及DIGFA免疫检测方法，鳗鱼加标检测的结果表明，两种方法均能够对恩诺沙星等6种以上的喹诺酮残留实现有效测定，其中ELISA方法对于10μg kg-1和20μg kg-1加标样本的平均回收率基本达到75％以上，相对标准偏差基本处于15％以内；DIGFA检测的检测限为20μg kg-1以下，检测时间可缩短到半小时以内，检测结果可以肉眼读取而不依赖任何仪器，显示出较突出的简便性、快速性和现场适用性。
平衡透析方式;喹诺酮;族特异性识别;食品安全检测
中国海洋大学
博士
水产品贮藏与加工
林洪;V.M.Mirsky
2008
中文
TS207
118
2008-12-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）