扇贝多肽抑制UVB诱导的小鼠胸腺淋巴细胞辐射损伤的研究
目的:建立紫外线B(UVB)对体外培养的小鼠胸腺淋巴细胞凋亡的病理模型，探讨在UVB辐射下，扇贝多肽(PCF)抑制UVB诱导的小鼠胸腺淋巴细胞辐射损伤的作用机制。
方法:采用正交实验设计，以流式细胞仪PI染色法测定细胞凋亡率，采用45 mJ/cm2的UVB辐射体外培养的小鼠胸腺淋巴细胞，确立凋亡的病理模型，实验分为六组：正常对照组、UVB模型组、UVB+5.69 mM PCF组，UVB+2.84 mM PCF组，UVB+1.42 mM PCF组和UVB+5.69 mM VitC组。首先研究PCF对UVB辐射小鼠胸腺淋巴细胞后氧化还原状态的影响，UVB辐射后测定细胞抗羟自由基、抗超氧阴离子的水平、黄嘌啉氧化酶(XOD)和NADPH氧化酶活力；以2，7-二氯氢化荧光素二酯(DCFH-DA)为荧光探针，检测PCF对UVB照射后细胞内ROS生成的影响。其次，研究PCF对UVB诱导小鼠胸腺淋巴细胞凋亡的线粒体通路和表面受体通路的影响，分别用Rhodamine 123和Fluo-3-AM荧光染色测定线粒体膜电位和细胞内游离钙的变化；免疫细胞化学检测细胞Bcl-xl和Bid基因蛋白的表达；流式细胞仪检测caspase-3的活性；western-blot检测线粒体细胞色素C(cytochromec)的释放、FADD和caspase-8基因蛋白的表达；电镜分析PCF和caspase-8抑制剂(z-IETD-fmk)对UVB诱导的胸腺淋巴细胞凋亡的影响；RT-PCR检测Fas(CD95)mRNA的表达。最后，使用基因芯片技术分析PCF对UVB辐射后小鼠胸腺淋巴细胞基因谱的差异表达影响。Westem-blot检测硫氧还蛋白(Trx)、蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(Akt/PKB)的活性，预先加入或不加入PI3K/Akt通路特异性抑制剂LY294002检测细胞凋亡信号调节激酶Ⅰ(apoptosis signal regulating kinase-1，ASK1)、JNK的活性、DNA ladder和线粒体膜电位(△ψM)；免疫细胞化学检测细胞p53基因蛋白的表达：原位杂交检测细胞p38 mRNA、p21 mRNA的表达；RT-PCR检测c-fos mRNA和c-jun mRNA的表达；结果正交实验结果表明，45 mJ/cm2的UVB辐射小鼠胸腺淋巴细胞后2h为最佳凋亡模型；在1.42mM～5.69mM浓度范围内，PCF能提高抗羟自由基和抗超氧阴离子的水平，降低胸腺淋巴细胞中黄嘌啉氧化酶、NADPH氧化酶的活力和ROS的含量。PCF可调节线粒体通路和表面受体通路上凋亡相关分子的表达，稳定线粒体的膜电位，降低淋巴细胞内游离钙离子，使Bcl-xl蛋白表达升高而Bid蛋白表达降低：PCF抑制线粒体cytochrome c的释放，使caspase-3的活性降低；PCF可抑制表面受体通路上Fas mRNA、FADD和caspase-8基因蛋白的表达：当预先给予caspase-8抑制剂和PCF能够减轻UVB对细胞超微结构的损害。基因芯片结果显示，与模型组相比，PCF组有功能差异表达的基因共104个，其中上调基因56个，下调基因48个：western-blot结果提示，PCF能够提高小鼠胸腺淋巴细胞硫氧还蛋白的表达，激活AKT的活性，抑制ASKl-JNK/p38凋亡通路的活化。预先使用P13K/Akt通路特异性抑制剂LY294002，DNA ladder片段增多，线粒体膜电位降低；此外，PCF可提高细胞周期相关基因p53蛋白的表达和p21mRNA的表达；降低转录因子c-fos mRNA和c-jun mRNA的表达。
结论：PCF能够改善由UVB辐射诱导的细胞氧化损伤，从根本上降低活性氧自由基的产生，是较好的海洋类抗氧化剂；PCF能够抑制线粒体凋亡信号通路和膜表面受体凋亡信号通路；提高抗氧化蛋白、细胞生存相关基因，抑制ASK1-JNK/p38凋亡通路的活化，抑制转录因子的表达，PCF通过调节细胞氧化还原、凋亡、信号转导、细胞周期、转录调节等众多基因的表达，起到抗氧化、抗凋亡、抑制UVB对小鼠胸腺淋巴细胞辐射损伤的作用。上述结果表明，PCF是海洋类抑制UVB辐射的优质防护剂。
胸腺淋巴细胞;辐射损伤;扇贝多肽;UVB诱导;活性氧自由基
中国海洋大学
博士
药物化学
于文功;王春波
2008
中文
R818;R96
126
2008-12-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）