对虾白斑症病毒囊膜蛋白单克隆抗体的研制及中和抗体筛选
白斑症病毒(WSSV)病是危害对虾养殖业健康发展的主要疾病之一，十余年来国内外学者已对其进行了大量研究。由于WSSV的囊膜与靶细胞相互作用从而介导病毒对宿主的感染，因此探明这一机理并进而阻断，成为防控WSSV感染的重要途径。本文通过抗WSSV不同囊膜蛋白单克隆抗体的研制，分别获得了抗VP28，VP26及VP19线性表位的单抗；通过WSSV囊膜蛋白单克隆抗体对WSSV的体内与体外中和，筛选得到两株具明显病毒中和作用的抗VP28单抗；应用抗VP28单抗检测分析VP28与宿主细胞的作用关系，论证了其在WSSV感染中的作用：另外，论文通过单抗标记及流式细胞术检测螯虾血细胞内的WSSV，分析了机体感染进程中WSSV对血细胞的感染规律。具体研究内容和结果如下：
(1)WSSV囊膜蛋白单抗的研制。差速离心和蔗糖密度梯度离心从对虾鳃组织中分离获得WSSV，之后通过SDS-PAGE、切胶、蛋白洗脱方式分离获得病毒系列蛋白(VP31、VP28、VP26、VP19、以及VP76和VP51左右蛋白)。以获得的病毒蛋白为抗原免疫Balb/C小鼠，采用单克隆抗体技术经细胞融合、筛选、有限稀释法克隆共获得3种抗WSSV囊膜蛋白线性表位的单抗，其中抗VP28单抗8株(1D6、2C8、2G3、2H5、3A6、3E1、485、5D2)，抗VP26单抗3株(2D10、3G7、3H9)，抗VP19单抗2株(2C7、2E9)。间接免疫荧光证明各株单抗均与感染WSSV的虾鳃切片呈特异性反应；Western-blot实验证明上述三组单抗所结合的抗原决定簇分别位于WSSV的VP28、VP26以及VP19上；抗体的亚型分析测定结果表明：单抗lD6，2G3，2H5，3.A6，3E1，485，5D2，3G7，3H9，2C7和2E9属IgG亚型：单抗2C8和2D10属IgM亚型。
(2)单抗对WSSV的体内中和。以克氏原螯虾(Cambarus proclarkii)动物模型检测WSSV各囊膜蛋白单抗的中和效果。从自然感染的对虾组织中粗提WSSV，将病毒液作一定浓度稀释后与单抗1:1孵育2h，之后皮下注射克氏原螯虾(50μl/只)，观察记录螯虾的死亡情况。结果显示2株VP28单抗(1D6，2G3)与病毒混合作用后感染的螯虾组出现死亡的时间(4d，3d)和达到100％死亡率的时间(13d，12d)比对照组(注射未经单抗作用病毒，1d，7d)明显延迟，其他单抗组与对照组相近或稍有提前。结果表明1D6和2G3可明显延缓WSSV对宿主的感染，部分中和了WSSV的感染力。
(3)单抗对WSSV的体外中和。通过ELISA实验分析单抗对WSSV与对虾血细胞膜结合的阻断效果验证单抗的中和性。提取中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)血细胞膜并对WSSV进行地高辛(DIG)标记，将病毒和各单抗混合作用后吸附对虾血细胞膜，使用抗地高辛抗体检测结合到血细胞膜上的病毒。结果显示单抗1D6，2G3组WSSV的结合量(OD值：0.207，0.235)明显低于对照组(病毒未与单抗作用，OD值：0.401)，其它单抗组与对照组差异不明显。结果表明单抗1D6，2G3可以明显降低WSSV和血细胞膜的结合，通过阻碍WSSV与宿主细胞的结合进而延缓病毒感染，两株单抗均具有部分中和作用。
(4)VP28与靶细胞作用关系的分析。中国对虾血细胞与提纯的VP28作用后，应用VP28单抗进行免疫荧光染色，结果显示对虾血细胞与VP28作用后细胞边缘呈现特异性荧光亮点：中国对虾血细胞膜与提纯的VP28作用后，应用VP28单抗进行ELISA实验，结果显示呈现阳性反应；对虾血细胞电泳转移至硝酸纤维素膜，铺覆VP28作用后，应用VP28单抗进行免疫印迹试验，结果显示VP28与中国对虾血细胞膜上的72kDa蛋白结合。以上三项实验均表明洗脱提纯的VP28可与对虾血细胞膜特异性结合，其通过与宿主细胞的黏附作用介导病毒感染，同时推测VP28作用的关键位点为线性结构。
(5)WSSV对克氏原螯虾血细胞的感染。通过皮下注射WSSV感染螯虾后每24h收集血细胞，经WSSV单抗及荧光二抗染色后应用流式细胞仪检测，同时记录累积死亡率及血细胞密度。结果显示感染后1-5天：螯虾的累积死亡率为3.3，13.3，16.7，36.7，70.0(％)：血细胞被感染比例为6.47，6.93，10.65，26.08，4.94(％)：被感染细胞平均荧光强度为10.7，10.89，11.7l，13.77，15.47：血细胞密度(×106个/ml)为7.56±0.30，5.60±0.24，4.2l±0.30，1.45±0.26，1.21±0.21(未感染为5.34±0.22)。以上结果表明，在机体感染进程中，螯虾血细胞密度呈现先升高后下降的趋势，至后期仅为感染前的1/5；血细胞被感染率同时也呈现了先上升后下降的变化趋势，但被感染血细胞中的病毒量则始终呈上升趋势；血细胞处于最高感染率时机体濒临死亡，表明血细胞的WSSV感染程度与机体的感染状况密切相关。
综上，本论文在获得WSSV多种囊膜蛋白单克隆抗体的基础上，成功筛选到两株能够明显中和WSSV的单抗，这为进一步应用中和抗体阻断WSSV感染提供了工具：同时，应用VP28单抗表明了提纯的VP28可通过与宿主细胞发生特异性结合作用，为明确WSSV囊膜蛋白在病毒感染中的作用提供了参考和依据：论文的研究结果对WSSV感染机理和防治研究具有重要意义。
白斑症病毒;对虾;囊膜蛋白单克隆抗体;抗体筛选
中国海洋大学
博士
水生生物学
战文斌
2008
中文
S945.46
111
2008-12-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）