海洋酵母Kodamaea ohmeri BG3植酸酶的生产、分离纯化、基因克隆及表达的研究
采用单因子试验和表面响应的方法相结合，对产植酸酶培养基组分及条件进行了优化，结果如下：燕麦1.0％(w/v)，葡萄糖2.0％(w/v)，硫酸铵2.3％(w/v)氯化钠2.0％(w/v)，初始pH6.3，培养温度28℃，培养72h植酸酶的产量达到最高575.5 U/mL，这同软件预测的569.16 U/mL基本相一致。
K.ohmeri BG3胞外植酸酶酶通过分子筛SephadexTM G-75和阴离子交换层析柱DEAE Fast Flow分离纯化，纯化倍数和回收率分别为7.2和10.4％。纯化后植酸酶SDS-PAGE凝胶电泳显示分子量约为98.2 kDa。纯化酶的最适反应pH和最适反应温度分别为5.0和65℃，该酶的温度稳定性较好，在pH3-9范围内稳定性也较好。Mn2+、Ca2+、 Mg2+、Li+、K+、Na+、Ba2+和CO2+在浓度5.0mM时对纯化植酸酶有激活作用；而zn2+、Fe2+、Fe3+、Hg2+、Ag+、 Cu2+在浓度5.0 mM时，对纯化的植酸酶有抑止作用。纯化的植酸酶活性被Phenylgloxal hydrate强烈抑制，因此分离纯化的植酸酶属于组氨酸酸性磷酸酶。纯化的植酸酶对底物植酸的动力学常数Km值和Vmax分别是1.45 mM和0.083 mM/min。
用简并引物法扩增了编码海洋酵母K.ohmeri BG3植酸酶的部分基因，片段长度为1023 bp，NCBI登录号为EU009483。用RACE的方法扩增出了海洋酵母ohmer BG3植酸酶基因5′和3′两端的区域，推导出了该植酸酶基因ORF框，共为1389 bp(NCBI登录号：EU082006)。通过比对海洋酵母K.ohmeri BG3植酸酶的基因序列和cDNA序列，发现两者完全一致，说明该基因没有内含子。K.ohmeri BG3植酸酶基因中含有两个酸性磷酸酶所特有的保守区域RHGXRXP和HD区域，这也说明该植酸酶属于酸性磷酸酶家族的一员。根据基因推导出K.ohmeri BG3植酸酶的氨基酸序列，共462个氨基酸，分子量为51.9 kDa。有一段含有15个氨基酸的信号肽，有6个糖基化位点。分析了K ohmeri BG3植酸酶的氨基酸序列与其他植酸酶氨基酸序列的同源性，发现其与C.albicans(xP_713452)和P.stipitis XP 001385108)植酸酶亲缘关系最近，同源性分别为61％和58％。
利用pET表达系统成功实现了植酸酶基因PHYI在大肠杆菌中的表达，重组蛋白部分以活性蛋白形式存在，而大部分以包涵体形式存在。SDS-PAGE显示重组蛋白的分子量约为51 kDa。重组酶的最适反应pH和最适反应温度分别为5.0和65℃，该酶的热稳定性较好，在pH 3-8范围内稳定性也较好。重组酶在较短时间内可以将植酸水解为不同大小的水解产物，但不能将植酸彻底水解为肌醇。
海洋酵母;植酸酶;表面响应;植酸酶基因PHYI
中国海洋大学
博士
微生物学
池振明
2008
中文
Q93;TQ925
116
2008-12-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）