海洋酵母菌Metschnikowia reukaufii W6b酸性蛋白酶的生产、基因克隆和表达的研究
从海洋中分离的近400株酵母中筛选出1株产酸性蛋白酶的海洋酵母菌W6b，并初步确定该酶为细胞结合蛋白酶，命名为SAP6。通过酵母鉴定的常规方法并结合分子生物学方法，对该菌株进行鉴定，鉴定结果为鲁考弗美奇酵母(Metschnikowia reukaufii)。
研究了菌株W6b的合成酸性蛋白酶的培养条件，产酶的最适条件为葡萄糖1％、酪蛋白1.5％、酵母粉0.5％、海水配制，培养基初始pH为pH5.0，接种量为7.5×107个细胞/50mL，发酵培养基，28℃、140rpm振荡培养，在上述条件下培养48h酸性蛋白酶酶活最高可达到72.5U/mL。粗酶的最适作用温度为40℃，最适作用pH为3.4。
利用简并PCR与SMARTRACE PCR克隆到了该酸性蛋白酶基因SAP6。基因SAP6的cDNA全长序列为1755bp，SAP6基因组序列中没有内含子，含开放阅读框(ORF)1527bp，编码508个氨基酸，蛋白酶前体分子量为53486Da。推导的SAP6氨基酸序列与米曲霉(Aspergillus oryzae)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和近平滑假丝酵母(Candida parapsilosis)的酸性蛋白酶氨基酸序列相似度分别为18.11％、20.52％和28.6％。通过分子生物学软件分析，基因SAP6有一个含16个氨基酸残基的信号肽序列，一个真核Asartyl(acid)蛋白酶家族(EC 3.4.23)序列特征的保守区，两个真核和病毒(Eukaryotic and viral)天冬氨酸活性位点，6个N-糖基化位点。Kyte和Doolittle疏水性分析显示SAP6与酿酒酵母细胞壁锚定的酸性蛋白酶具有高度相似的GPI-锚定结构。
将cDNASAP6克隆到大肠杆菌pET-24a(+)表达载体中，构建了表达载体pET-24a(+)SAP6，在大肠杆菌BL21(DE3)中利用IPTG进行诱导表达，重组蛋白通过SDS-PAGE和Immunoblotting鉴定分子量为54kDa，重组酸性蛋白酶粗酶液与SAP6一样具有牛奶凝固特性和水解蛋白形成透明圈的能力，证明克隆到的基因。SAP6确实为酸性蛋白酶基因。这是关于美奇酵母属酸性蛋白酶基因克隆和表达的首次研究报导。通过Ni柱亲和层析法对重组酸性蛋白酶进行了纯化，纯化的重组蛋白通过SDS-PAGE和Immunoblotting鉴定分子量为54kDa。重组酸性蛋白酶的最适作用温度是40℃，在40℃以下重组酶的热稳定性较好，40℃以上酶活迅速下降；最适pH为3.4，在pH 2.6～5.0范围内有较好的稳定性。Mn2+对重组酶的活性有轻度的激活作用， Cu2+对重组酶的活性有较大的抑制作用，与已报导的酵母菌和霉菌酸性蛋白酶差异明显，表明SAP6可能为新型酸性蛋白酶。重组酶明显受Pepstatin的抑制，EDTA基本对重组酶活性无抑制作用；PMSF和碘乙酸对重组酶活力基本无影响，SDS可部分抑制酶的活力，说明重组酶为天冬氨酸蛋白酶。
海洋酵母菌;酸性蛋白酶;鲁考弗美奇酵母
中国海洋大学
博士
微生物学
池振明
2008
中文
Q814;Q78
123
2008-12-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）