诺如病毒衣壳蛋白的原核表达与抗血清的制备
诺如病毒(Norovirus，NV)是目前继轮状病毒后，致使人类非细菌性腹泻的第二大病原。人类主要通过被污染的食物摄入诺如病毒，而在被污染的食物中牡蛎占了主要部分。诺如病毒作为一种食源性腹泻病毒首先在美国被发现后，世界各地相继出现了有关诺如病毒的报道。近些年，世界各地相继爆发了大规模的诺如病毒引起的急性肠胃炎疫情，许多国家已对我国进出口水产品中诺如病毒的检测提出要求，因此，对诺如病毒的检测已不能仅仅局限于原来的实验室复杂、繁琐的检测，快速、经济且适用于大量样品的检测的方法的研究已日趋重要。但目前，世界上还没有一种快速、有效且价格低廉的诺如病毒检测试剂盒。
诺如病毒变异性大，检测困难，但利用原核表达的诺如病毒衣壳蛋白，其特异性保守的11个氨基酸可以很好的展示在外，利用这种蛋白免疫动物，可以获得具有广泛识别能力的抗血清，该抗血清可以从一定程度上解决诺如病毒变异性强、难于检测的缺点。
本实验通过大肠杆菌表达诺如病毒衣壳蛋白，并制备抗血清，为诺如病毒的快速酶联免疫检测试剂盒的建立奠定了一定的基础。
具体研究结果如下：
1.通过Trizol法提取样品中的RNA，通过对诺如病毒RNA聚合酶基因片段(特异性保守区域)的RT-PCR扩增与测序得到该基因片段的核苷酸序列，该核苷酸序列长301个碱基，通过对序列用DNA Star Megline、MEGA软件进行分析和通过NCBI网站进行在线BLASTN分析，确定该病毒株为NV G Ⅱ型。
2.由于NV GⅡ-3型与NV G Ⅱ-4型，都是我国流行病毒株型，且具有很高的同源性因此，因此本实验后期通过对GⅡ-4、GⅡ-3型病毒代表株衣壳蛋白基因同源性比较，设计简并引物对分离病毒株衣壳蛋白基因进行PCR扩增，结果显示，只有G Ⅱ-3简并引物可以扩增出特异性目的带。将PCR扩增产物进行基因测序与序列分析表明该病毒株衣壳蛋白基因共1647个碱基，与G Ⅱ-3型病毒代表株衣壳蛋白基因长度相同，通过对该病毒株衣壳蛋白基因与GⅡ-3、GⅡ-4代表株的同源区域相似性比较，得出，该病毒株衣壳蛋白基因与NV GⅡ-3型的同源相似性大于NV GⅡ-4型。
3.用DNAtools对衣壳蛋白基因进行分析发现，在衣壳蛋白基因在扩增过程中未产生终止密码子突变，可用于表达，此外，在该衣壳蛋白氨基酸序列N末端，含有YODA提出的11个氨基酸保守区域QQNIIDPWIMN，该区域位于诺如病毒衣壳蛋白抗原表位，为NV GⅠ、GⅡ型共有。
4.将衣壳蛋白基因插入表达载体pQE30，构建重组质粒，转化大肠杆菌M15，IPTG诱导蛋白表达，Ni-NTA亲和层析分离纯化目的蛋白，通过SDS-PAGE电泳判断出该衣壳蛋白大小约60kDa。
5.将纯化的衣壳蛋白免疫新西兰大白兔，制备抗血清，并通过间接ELISA方法对抗血清效价进行测定。结果表明该抗血清效价可达到1:10000，符合酶联免疫检测的要求。
诺如病毒;抗血清;衣壳蛋白
中国海洋大学
硕士
海洋生物学
薛长湖
2008
中文
Q78
79
2008-12-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）