产纤维素酶海洋普鲁兰类酵母的初步研究及CMCase的纯化与性质研究
从实验室海洋酵母菌种库的300余株海洋酵母菌中通过刚果红筛选平板初筛选得到19株能产纤维素酶的海洋酵母菌，经过复筛得到一株纤维素酶活力相对较高的菌株98，该菌株分离自中国青岛东风盐场表层海水。通过传统的酵母菌种鉴定及分子生物学鉴定，最终鉴定该株海洋酵母菌属于普鲁兰类酵母(Aureobasidium pullulans)。对其发酵产酶培养基进行了优化，其最适产酶培养基组成为(w/v)：2.0％可溶性淀粉，0.5％蛋白胨，2.O％酵母粉，海水配制，起始pH值调至7.0。在28℃，160r/min振荡培养24h后，产葡聚糖内切酶(CMCase)活达到4.51U/mg，滤纸酶活达到4.75U/mg。并对粗酶液的水解产物进行了薄层层析研究，发现纤维素酶水解羧甲基纤维素钠(CMC)和滤纸的酶解产物大部分是单糖，另外有少量的二糖。这是首次关于海洋酵母菌能够产生纤维素酶的报道。通过SephradexTM G-75凝胶过滤层析和DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析方法对海洋普鲁兰类酵母菌株98所产葡聚糖内切酶(CMCase)进行了纯化，最终得到一个纯的葡聚糖内切酶组分，SDS-PAGE检测该葡聚糖内切酶(CMCase)分子量大约为67kDa，组分单一，最终纯酶与原样品相比，纯化倍数1.98倍，回收率15.3％。该纯化的CMCase大小与己知有些纯化的黑曲霉的纤维素酶(CMCase)的分子量相仿。对纯化的CMCase进行了性质研究，发现纯化的CMCase在40℃时酶活最高，在温度低于30℃时是稳定的，当温度高于45℃时，酶活迅速降低。此CMCase在pH5.6时酶活达到最高，在pH5.0到pH6.0时酶活相对较为稳定，只有pH低于5.0或高于6.0时酶活明显的降低。金属离子对纯化的CMCase酶活的影响，其中Na+、Mg2+、Ca2+、K+、Fe2+、Cu2+对酶活有激活作用，而当存在Fe3+、Ba2+、Zn2+、Mn2+、Ag+时，CMCase活性受到抑制，特别是Ba2+存在时酶活明显降低。蛋白抑制剂(PMSF、SDS、EDTA、EGTA、DTT、碘乙酸)对纯化的CMCase的活性均有抑制作用，其中SDS对纤维素酶CMCase活性影响最大，纯化的CMCase对底物CMC的Km值和Vmax分别是4.73 mg/mL和0.566μmol/min/mg蛋白，并利用纯化的CMCase(葡聚糖内切酶)水解羧甲基纤维素钠(CMC)，对水解液进行薄层层析分析，显示纯化的CMCase具有β-1，4-葡聚糖内切酶活性，能够随机水解CMC内部的β-1，4-糖苷键，水解产生除单糖之外的低聚寡糖，说明该纯化的酶确实为β-1，4-葡聚糖内切酶。
产纤维素酶;普鲁兰类酵母;CMCase
中国海洋大学
硕士
海洋生物学
池振明
2008
中文
TQ925
79
2008-12-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）