大菱鲆红体病虹彩病毒主要衣壳蛋白与宿主蛋白的相互作用研究
大菱鲆红体病虹彩病毒(turbot reddish body iridovirus，TRBIV)是我国养殖大菱鲆病毒性疾病的主要病原之一，TRBIV主要衣壳蛋白(Major Capsid Protein,MCP)是病毒最主要的结构蛋白。本研究运用酵母双杂交系统，筛选与TRBIV MCP相互作用的大菱鲆脾细胞蛋白，从而揭示虹彩病毒感染宿主细胞的分子机制，为鱼类虹彩病毒的致病机理研究打下基础。
首先，构建了用于酵母双杂交的诱饵质粒pDEST32-MCP。采用invitrogen公司的pENTR Directional TOPO Cloning kit构建了pENTR-MCP质粒；pENTR-MCP与载体pDEST32应用Gateway重组反应得到pDEST32-MCP质粒，经酶切鉴定确定重组子。
利用CloneMiner.cDNA Library Construction Kit构建了大菱鲆(Scophthalmusmaxims)脾细胞cDNA文库。从大菱鲆脾细胞中提取总RNA，再分离纯化出mRNA。逆转录得到第一链cDNA，继而合成了双链平末端cDNA。经纯化定量后，应用GatewayBP技术同源重组，得到pDONR222-cDNA，从而获得大菱鲆脾细胞cDNA文库。经测定扩增后文库滴度为2.52×107cfu/ml，插入片段大部分分布在500-1000bp之间，平均大小约为787.6bp，可用作酵母双杂交的筛选文库。
将pDEST32-MCP转入酵母菌株MaV203，通过自激活检测确定3AT浓度。pDONR222-cDNA通过Gateway LR重组反应与pDEST22载体连接，得到pDEST22-cDNA并转化入含有pDEST32-MCP的酵母菌株MaV203，分别在选择性平板上筛选阳性克隆，阳性克隆经序列测定p22大小为1117bp，p23大小为891bp，p31大小为491bp，p31与p23部分重合。分析结果表明，p23与60s核糖蛋白L23有很高的同源性，相似度达100％；p22无较大范围内的同源序列，说明是新的基因片段。另有4个表型为强阳性的克隆经鉴定不属于cDNA片段，其来源及序列结构有待进一步研究。
大菱鲆红体病虹彩病毒;主要衣壳蛋白;大菱鲆;酵母双杂交;蛋白相互作用
中国海洋大学
硕士
水生生物
史成银;孔晓瑜
2008
中文
S943
68
2008-12-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）