致病性迟缓爱德华氏菌的鉴定、PCR检测及esaC基因的功能鉴定
迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)是一种革兰氏阴性肠道菌，感染宿主范围广。由该菌引起的爱德华氏菌病是水产养殖最常见的传染病之一，给水产业造成巨大的经济损失。本研究从发病大菱鲆分离和鉴定了2株迟缓爱德华氏菌，建立了致病性迟缓爱德华氏菌的PCR检测方法，对esaC基因的功能进行了鉴定，构建了迟缓爱德华氏菌的三个基因缺失突变株并进行初步鉴定，为将来用于筛选减毒活疫苗打下基础。主要结果如下：
一、迟缓爱德华氏菌的分离鉴定：从两个养鱼场的发病大菱鲆分离得到了2株优势菌JN和MHK2。人工感染大菱鲆实验表明JN和MHK2对鱼的半数致死浓度(LD50)分别为105.4cfu/ml和105.6cfu/ml。对JN和MHK2的16s rDNA序列分析表明，它们与迟缓爱德华氏菌的序列相似性为99％。API ID32E生理生化检测表明，它们与标准迟缓爱德华氏菌的各项反应指标高度一致。因此将JN和MHK2鉴定为迟缓爱德华氏菌。
二、致病性迟缓爱德华氏菌的PCR检测：以迟缓爱德华氏菌的主要毒力因子-Ⅲ型分泌系统(T3SS)的装置蛋白基因esaV、过氧化氢酶基因katB为靶基因，设计特异性引物用于迟缓爱德华氏菌PCR检测。结果表明，在11株致病性菌中都检测到了esaV和katB基因的存在；在13株非致病性菌株中均没有检测到esaV基因，有4株检测到katB基因。根据上述结果，esaV基因可以作为区分致病性和非致病性迟缓爱德华氏菌的一个分子标记。
三、esaC基因的功能鉴定：迟缓爱德华氏菌T3SS的1个装置蛋白。本研究采取基因缺失突变技术，构建了esaC基因缺失突变株。Westemblotting分析表明，由于esaC基因的缺失，迟缓爱德华氏菌T3ss的输送器蛋白(EseB，EseC，EseD)虽然可以正常的表达，但是不能分泌到细胞外，同时细菌的自凝聚现象消失。毒力检测发现，突变株对蓝曼龙鱼的半数致死浓度(LD50)比野生型菌株提高了10倍。结果表明，esaC基因影响迟缓爱德华氏菌的毒力和T3SS相关蛋白的分泌。本研究进一步确定了esaC基因作为迟缓爱德华氏菌T3SS装置蛋白的功能，加深了对迟缓爱德华氏菌致病机理的了解。
四、三基因缺失突变株的构建和初步鉴定：利用基因缺失突变技术，构建了迟缓爱德华T3SS基因esrB、T6SS(Ⅵ型分泌系统)基因evpH、芳香族氨基酸合成酶基因aroA的三基因缺失突变株。人工感染实验表明，该突变株的毒力大大下降，LD50>108cfu/ml。细菌在鱼体内存活实验表明，该突变株细菌在牙鲆鱼体内的存活时间不超过18天，在21天可检测到牙鲆血清产生凝集抗体。结果表明，该迟缓爱德华氏菌的三基因突变株作为减毒细菌，可用于下一步的减毒疫苗筛选和鉴定工作。
迟缓爱德华氏菌;致病性;PCR检测;esaC基因
中国海洋大学
硕士
动物学
茅云翔;莫照兰
2008
中文
S941;S943
55
2008-12-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）