琼胶酶β-AgaA结构和功能关系的研究
琼胶酶是能够降解琼脂糖的水解酶。近年来，随着越来越多的性质不同的琼胶酶的发现以及对琼胶酶的结构和功能特别是降解琼脂糖的作用机制进一步研究，使得琼胶酶的应用日益广泛。本研究利用生物信息学方法分析了琼胶酶β-AgaA在家族内结构上的共性和特异性，从GenBank数据库中搜索所有的琼胶酶的基因序列或者氨基酸序列，序列同源性较高的水解酶利用ClustalW软件、BioEdit等软件进行分析:利用己知的糖水解酶的晶体结构为模型，使用SWISS-Model, SYBYL-FUGUE软件等进行同源建模，构建GH16家族琼胶酶的分子模型;用AutoDock等软件模拟琼胶酶和底物复合物的分子模型;以Ligplot等软件确定酶和底物之间的相互作用，获得酶的三级结构信息。根据生物信息学研究给出的结果设计分子生物学实验，研究β-AgaA的催化活性和催化机制。以质粒agaA为模板，利用大引物PCR法和Quikchange试剂盒对β-AgaA进行氨基酸突变实验，构建了六个突变体:H71N, F185L, N103T,S182I,H189-190AA和WTS 109-112GCHL。经过表达和酶活测定，结果表明TH189-190AA和VVTS109-112GCHL的突变导致了酶的活性几乎全部丧失;而F185L的突变会引起的活性部分丧失;其他三个突变体活性较野生型无明显差异。推测原因可能由于突变前后蛋白质结构的变化，引起突变后侧链发生了改变，因此影响了蛋白质的正确折叠或者是对底物的结合能力，从而使活性发生改变，由此可以推断这些位点在酶活发挥过程中起到非常重要的作用。本研究还利用荧光辅助碳水化合物电泳(FACE)法对突变体酶降解琼脂糖的产物进行了分析，结果表明所预测的突变体均不能改变降解模式，终产物仍然是新琼六糖和新琼四糖。由此我们得出:这些位点并不是酶催化的关键功能位点:单纯的改变某一位点，不会引起酶的催化机制的改变。
琼胶酶;同源建模;降解模式;催化功能;生物信息学;氨基酸突变实验
中国海洋大学
硕士
生药学
于文功
2008
中文
Q556.2
76
2008-12-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）