IHHNV和LCDV实时定量PCR检测方法的建立与应用
传染性皮下及造血器官坏死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus，IHHNV)可感染世界各地养殖对虾，给对虾养殖业造成严重经济损失。本研究首次采用实时定量PCR法对广西地区的84份凡纳滨对虾样品进行检测，同时以常规PCR检测作对照。实时定量PCR检测阳性率为79.8％，常规PCR检测阳性率为40.5％，且常规PCR检测呈阳性的样品均包含在实时定量PCR检测呈阳性之中，也表明广西地区养殖的凡纳滨对虾IHHNV的感染率较高。将两者检测均呈阳性的30份样品扩增产物进行序列分析测序，测序结果通过DNA STAR软件包进行分析，并通过NCBI Blast与GenBank中的序列进行比对，结果证明测定的是IHHNV序列。30份样品的IHHNV序列很保守，可以分为4种类型，仅有两个碱基的位置发生变异。实时定量PCR检测IHHNV，快速、灵敏、准确，特异性好，可以作为检测对虾感染病毒的有效方法。
淋巴囊肿病毒(Lymphocystis disease virus，LCDV)广泛分布于世界各地的淡水、半咸水和海水中，可感染9目34科计140种以上鱼类。淋巴囊肿病是对鱼类危害较为严重的病毒病之一，其感染率可高达80％，死亡率可达30％。本研究建立Taqman、SYBR Creen I实时定量PCR方法检测淋巴囊肿病毒。选取LCDV的主要衣壳蛋白(major capsid protein，MCP)基因保守序列，利用Primer Express 2.0软件设计引物和探针。
Taqman实时定量PCR中，以梯度稀释的含有LCDV目的扩增片段的质粒作为标准品，进行灵敏度检测，质粒浓度为3×107～30个拷贝内都有扩增曲线，检测限为30个病毒拷贝。根据病毒拷贝数(X)与Ct值的关系，制备了标准曲线。拷贝数(X)与Ct的关系为：Ct=-3.631gX+41.86，相关系数R2=0.9915。特异性实验中，Taqman实时定量PCR对流行性造血器官坏死病毒(Epizootic haematopoietic necrosis virus，EHNV)、蛙虹彩病毒(Bohle iridovirus，BIV)、新加坡石斑虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus，SGIV)、真鲷虹彩病毒(Sea bream iridovirus，RSIV)都没有扩增反应。利用建立的方法对我国养殖场的鱼类进行检测，共检测到12批LCDV阳性样品，并利用标准曲线对病毒进行了定量分析。将阳性样品的常规PCR产物进行纯化测序，证实是LCDV序列。Taqman实时定量PCR检测LCDV，灵敏度高，特异性好，可以进行定量分析，可成为一种早期检测LCDV的新方法。
SYBR Green I实时定量PCR中，优化了定量PCR的反应条件，反应体系的最佳引物浓度为0.5μM。该方法能特异检测出淋巴囊肿病毒，不能扩增流行性造血器官坏死病毒(Epizootic haematopoietic necrosis virus，EHNV)、虎纹蛙病毒(Tiger frog virus，TFV)、蛙虹彩病毒(Bohle iridovirus，BIV)、新加坡石斑虹彩病毒(Singapore grouper iridovirus，SGIV)、鳜鱼传染性脾肾坏死病毒(Infectiousspleen and kidney necrosis virus，ISKNV)及真鲷虹彩病毒(Sea bream iridovirus,RSIV)。利用该方法对12份发病牙鲆鱼样品进行检测，均呈阳性。重复性测试中，SYBR Green I实时定量PCR检测LCDV质粒DNA显示出很好的批内重复性和批间重复性。建立的SYBR Green I实时定量PCR方法用于LCDV的检测具有成本低、特异、灵敏、重复性好等优点，同样可成为一种早期检测LCDV的新方法。
IHHNV;实时定量;PCR检测;淋巴囊肿病毒
中国海洋大学
硕士
水产品加工与贮藏工程
梁成珠;汪东风
2008
中文
S941
72
2008-12-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）