鳗弧菌基因组Fosmid库的构建及毒力相关因子的筛查
鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是一种对鱼类危害严重的细菌病原，常给水产养殖业造成巨大的经济损失。由于鳗弧菌的基因组信息尚未阐明，限制了许多研究工作的深入开展。本研究构建了鳗弧菌的Fosmid基因组文库，对文库的部分克隆进行了末端测序；根据序列的生物信息学分析，对可能的毒力相关因子进行了预测；在此基础上从文库克隆和鉴定了一个营养必须基因(aroA)和一个蛋白酶基因(prtV)。主要结果如下：
1、鳗弧菌Fosmid基因组文库的构建和鉴定本研究构建了鳗弧菌的Fosmid基因组文库，该文库包含960个克隆，插入片断平均长度为40kb。该文库覆盖鳗弧菌基因组(估计为5Mb)的9.1倍，得到任意单拷贝DNA序列的概率大于99％。同时我们建立了该文库的超级池和二级池，用于目的基因的的PCR筛选，所筛选的11个基因的阳性克隆数在2-11之间，表明该文库可以很好地用于目的基因的筛选。
2、鳗弧菌Fosmid基因组文库末端序列分析从鳗弧菌Fosmid基因组文库随机挑取600个克隆进行双末端测序，获得927条序列。加上原有随机片断文库的442条序列，共获得序列总长646，472bp，大约占基因组的19.35％。对这些序列进行如下分析：
首先，BLASTN比对结果表明在1369条序列中，有718条序列与数据库现有的序列有明显的相似性(E<e-5)，占测序总数的52.44％。BLASTX比对结果，与nr数据库序列相似的有1106条；与EST数据库相似的有826条。
其次，根据文库BLASTX的比对结果及相关文献资料，预测出与毒力相关的基因24个，分别为溶血素基因3个，重复序列毒素基因4个，鞭毛基因9个，菌毛基因2个，蛋白酶基因6个。
3、从鳗弧菌Fosmid基因组文库克隆aroA基因从鳗弧菌Fosmid基因组文库筛出含有aroA基因的克隆，经genomie walking PCR得到aroA全基因。该基因全长1281 bp，编码427个氨基酸残基，含有一个11个氨基酸残基的信号肽。分子量为46,177 Dalton。鳗弧菌aroA的蛋白编码序列与其他细菌的aroA同源，序列相似性在78％～82％。
4、PrtV基因的克隆及鉴定从鳗弧菌Fosmid基因组文库克隆prtV基因，该基因序列全长2778bp，编码926个氨基酸，分子量约102kDa。构建了PrtV基因插入失活突变株及其互补株。PrtV基因缺失后，生长能力有所下降，细菌的明胶酶活性、N-乙酰.葡萄糖胺酶活性下降，溶血活性下降，毒力与野生型相比下降了两个数量级，因此PrtV基因对鳗弧菌毒力有明显的作用。
鳗弧菌;基因组;毒力相关因子
中国海洋大学
硕士
海洋生物
茅云翔;莫照兰
2008
中文
S941.42;Q78
71
2008-12-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）