扇贝微卫星标记的筛选及其在物种鉴定中的应用
扇贝作为重要的经济贝类，其养殖业被迅速的开展起来，逐渐成为我国重要的增养殖贝类，而飞速发展的分子标记辅助育种体系为优良品种的快速培育提供了理论基础和实践经验。微卫星标记作为一种新兴的分子标记技术，加之其自身的优点，在扇贝遗传分析上的应用也日益得到重视。本研究以四种扇贝(栉孔扇贝、海湾扇贝、华贵栉孔扇贝和虾夷扇贝)为研究材料，筛选了四种扇贝的微卫星标记并对微卫星标记在扇贝肌肉柱和幼虫鉴定中的应用进行了探讨。
1.栉孔扇贝微卫星标记的筛选
搜索NCBI dbGSS数据库，得到栉孔扇贝序列3648条。用软件“Repeat Reporter Version1.5”查找得到核心序列为三碱基、四碱基的微卫星序列。经序列比对和引物设计、优化以及多态性检测后，共筛选得到24个具有多态性的标记，等位形式在2-9之间，平均等位形式数目为5.1。Ho和He的范围各自为0.000-0.7500和0.1866-0.8495，各位点之间没有明显的连锁不平衡现象，经Markov chain test检验24个位点中有12个偏离Hardy-Weinberg平衡。
2.海湾扇贝微卫星标记的筛选
搜索NCBI dbEST数据库中所有栉孔扇贝的EST序列7060条，并用软件搜索了所有可能的核心序列为两碱基、三碱基、四碱基、五碱基及六碱基的微卫星序列，结果193条序列符合严谨度，占整个ESTs库的2.73％。其中：两碱基重复含量>三碱基重复>五碱基重复>四碱基重复>六碱基重复。两碱基重复的微卫星含量最高的是(AT)n，其次是(AG)n，再次之为(AC)n。最后筛选得到20个多态性引物，共扩增得到92个等位基因，每个位点扩增得到的等位基因个数为2-11个，平均每对引物扩增出4.6个等位形式。观测到的杂合度和期望杂合度范围分别为0.0667-0.8000和0.0961-0.8253。
3.华贵栉孔扇贝微卫星标记的筛选
以华贵栉孔扇贝为材料，基因组DNA经Rsa I进行酶切，经过膜富集(AC)n和(AG)n后构建了华贵栉孔扇贝微卫星富集文库。运用菌落原位杂交的方法，使用(AC)n和(AG)n为探针经过杂交后，筛选得到阳性克隆，经测序共获得了60个华贵栉孔扇贝的微卫星序列，设计的22对引物中，10对引物的扩增产物具有多态性，等位基因数目从3到6个不等，平均等位形式数目为4.2，观测杂合度和期望杂合度从0-0.88和0.29-O.76。
4.虾夷扇贝微卫星标记的筛选
同上用富集文库的方法(HaeIII)筛选虾夷扇贝的微卫星标记，筛选得到的12个多态性位点中，扩增得到的等位基围从2个到8个不等，平均每个位点得到4.5个等位基因。观测到的杂合度范围为0-0.8333，期望杂合度范围为0.2546～0.8231。以上表明，这些微卫星标记都具有较高的多态性，均具有较高的信息含量，适合进行各种遗传学分析。
5.物种特异性微卫星标记的筛选及灵敏度检测
本研究共采用了72个微卫星标记进行物种特异性标记的确认。最后选取了8个在任何温度下只能在目的物种中扩增得到DNA片段的标记作为鉴定用标记。用幼虫进行灵敏度检测，结果显示各标记的检测灵敏度非常高：为2％和1％，该标记系统为扇贝的物种鉴定以及生态学调查提供了实验依据。
6.扇贝肌肉柱及幼虫鉴定本研究
利用以上8个标记组成的鉴定系统对三种产品(冷冻、干品和罐头)的7批样品进行了鉴定。结果显示，6批次的样品分别是单一物种组成的。其中编号为DM3的样品经过WAVE检测后发现，此批样品是栉孔扇贝和海湾扇贝的混合物。单个模板扩增的PAGE检测结果显示其中4个样品是栉孔扇贝，16个样品为海湾扇贝，因此，我们可以基本确定此批样品中栉孔扇贝和海湾扇贝的所占的百分比分别为20％4和80％。实验没有检测到华贵栉孔扇贝样品。
对于杂交幼虫的鉴定，结果显示：所有从养殖场取得的10批样品全部在某一物种处出现条带或者检测蜂，说明样品中的杂样应该低于1％(灵敏度)。反复取样的结果显示所有的幼虫都是由单一物种组成的。实验随机选取了4批大池幼虫，从中任意挑选至少72个个体进行单一幼虫模板的PCR扩增结果显示336个幼虫中306(91.1％)个扩增成功，结果显示所有的幼虫都是种内杂交产生。基于本研究结果，我们认为物种特异性微卫星标记能够在扇贝商品鉴定和幼虫鉴定中发挥巨大的作用。
扇贝微卫星标记;物种鉴定;经济贝类
中国海洋大学
硕士
生态学
包振民;胡景杰
2008
中文
S985.36
83
2008-12-08（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）