栉孔扇贝(Chlamys farreri)DNA断裂与海水高渗透压关系的探究

余小燕

中国海洋大学

摘要：

关于渗透压对细胞DNA影响的研究在陆地生物中很少,海洋生物则更少,本研究领域属于国际前沿。本文在栉孔扇贝原代培养血淋巴细胞的基础上,采用彗星实验和 TUNEL实验方法,从多角度双向验证了海洋的高渗透压(1200mOsm/L)会引起栉孔扇贝DNA的断裂,产生3’-OH末端。并且这种DNA断裂是可逆的,当外界环境的渗透压下降到低渗透压水平(460mOsm/L)时,DNA断裂又会自动修复。　　1.栉孔扇贝血细胞的原代培养　　首先,实验材料是栉孔扇贝的原代血淋巴细胞,采用的是1200mOsm/L的改进L-15培养基,在20℃,pH=7.6下进行培养,。血淋巴细胞在1~3天内已达到大量贴壁水平,培养3天内,血淋巴细胞细胞存活率高于90％。培养至10~15天,细胞逐渐死亡。培养3天以内的栉孔扇贝原代血淋巴细胞完全达到了进行彗星实验以及TUNEL实验的标准。　　2.彗星实验　　彗星实验中,以栉孔扇贝原代培养的血细胞为细胞材料,对数期生长的H1299细胞系为阴性对照,对原代血细胞培养物进行了32h连续监测,结果发现,低渗透压(460mOsm/L)细胞的Tail DNA%始终远远低于高渗透压(1200mOsm/L)中的细胞Tail DNA%,前者的Tail DNA%保持在6.04%到13.29%之间,后者的Tail DNA%自28.75%逐步升高至60.86%;交换渗透压后,低、高渗透压细胞的Tail DNA%情况也发生交换。因此证明:高渗透压环境会导致栉孔扇贝的血淋巴细胞DNA断裂,当渗透压降低时,又会诱导DNA断裂的修复。另外测量了扇贝个体的活体血淋巴细胞的Tail DNA%,结果发现,活体血细胞的Tail DNA%在不断变化,有时断裂程度较低,Tail DNA%约在10%以下;有时断裂程度较高,约在25%以上。　　3.TUNEL实验　　用TUNEL法对原代栉孔扇贝血淋巴细胞进行了体外实验,发现:在465-495nm波长下,高渗透压下培养的细胞有很强绿色荧光,DNA断裂情况严重。低渗透压下培养细胞几乎看不到绿色荧光,DNA断裂不明显;交换渗透压后,二者在465-495nm波长下的DNA绿色荧光情况发生互换,表明其DNA断裂情况发生了交换。因此,TUNEL实验可以再次证明在栉孔扇贝血淋巴细胞中存在高渗透压引发DNA断裂,低渗透压诱导DNA修复的现象。　　高渗透压贝产生的大量DNA断裂对于栉孔扇贝有什么生物学意义呢?扇贝长期生活在海水中,这些DNA断裂又会不会被修复呢?这些都是下一步有待研究的问题。

关键词：栉孔扇贝;原代培养;DNA断裂;高渗透压

授予单位：中国海洋大学

授予学位：硕士

学科专业：生物工程

导师姓名：包振民

学位年度：2014

语种：中文

分类号：Q178.53

页数：100

在线出版日期：2015-04-01（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）