产芳基硫酸酯酶菌株的筛选及酶学性质研究
芳基硫酸酯酶(Arylsulfatase)是一种催化裂解硫酸酯键,生成相应的醇和无机硫酸根的酶,该酶可以脱除琼胶分子中的硫酸根,进而可以替代对环境污染严重、产品得率低的化学方法,用于制备高品质的琼脂糖。本文以对硝基苯酚硫酸酯钾盐(pNPS)为筛选底物,首次从青岛海域红藻中分离筛选出一株能高效分泌芳基硫酸酯酶的菌株。该菌株经革兰氏染色为阴性,需氧,弯杆状,生理生化特征验证及16S rDNA序列分析确定为海单胞菌属,并将其命名为Marinomonas sp. FW-1,简称FW-1。 证实了菌株FW-1的产酶能力后,选取常用的pNPS法对其产酶能力进行定量分析。采用单因素-响应面方法对菌株 FW-1产芳基硫酸酯酶的培养条件及培养基成分进行优化。结果表明,其最佳培养基组分为(w/v):琼脂0.2％,酵母膏0.2%,蛋白胨0.5%, NaCl2.89%, MgCl2·6H200.412%, KCl0.1%, CaCl20.02%,K2HPO4·3H200.013%,FeCl2·4H2O0.002%,MnCl20.09%,焦磷酸钠0.043%,吐温-801.87%;最佳培养条件如下:初始 pH为7,培养温度为35℃,发酵时间为72h,接种量为1%,250mL锥形瓶装液量为50mL。在上述最佳培养基成分及最佳培养条件下,菌株 FW-1的产酶能力为1.07U/mL,酶活力相对于优化前提高了4.28倍。 菌株 FW-1能够稳定地产生芳基硫酸酯酶,该酶主要位于菌体细胞内部,在最适培养条件下发酵培养72h后,发酵液经低温离心、超声波细胞破碎、硫酸铵分级沉淀、透析除盐、超滤浓缩、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳原位检测及分离后得到粗酶液。纯度鉴定及分子量测定表明该酶的分子量约为60kDa。酶学性质实验表明,芳基硫酸酯酶的最适反应温度和 pH分别是45℃和11。该酶在4℃以下保存时较为稳定,在4℃放置72h后,酶活仍保留在95%以上,酶的热稳定良好,25℃保温48h后,酶活剩余90%左右,但当温度大于35℃时,6h以后酶活就开始急剧下降。该酶在 pH为7.0~11.0时具有良好的稳定性。当金属离子浓度为0.1mM/L时,K+、Ba2+和 Ca2+对芳基硫酸酯酶酶活力具有显著的促进作用, Hg2+能够抑制芳基硫酸酯酶酶活力,酶活下降了59%;当离子浓度为1mM/L时,Ba2+、Fe3+、Fe2+、Mg2+及 Ca2+对芳基硫酸酯酶酶活力具有显著的促进作用, Hg2+同样能够有效地抑制芳基硫酸酯酶酶活力,酶活大幅度下降了80%。利用纯化后的芳基硫酸酯酶对琼胶进行酶解实验,结果表明该酶可以有效地脱除琼胶中的硫酸根,对石花菜和江蓠琼胶的硫酸根脱除率分别为86.11%和89.61%。本研究为酶法制备琼脂糖提供了良好的理论基础和实践经验。
红藻;芳基硫酸酯酶;硝基苯酚硫酸酯钾盐;琼胶分子;海单胞菌属
中国海洋大学
硕士
食品工程
高昕
2014
中文
TS245.9;TS241
82
2015-04-01（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）