学位专题

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  • 1 文献综述
    1.1 赤潮与有害赤潮
    1.1.1 赤潮的危害
    1.1.2 赤潮藻
    1.1.3 东海原甲藻赤潮
    1.2 甲藻简介
    1.2.1 甲藻的分类
    1.2.2 甲藻属于介核生物
    1.2.3 甲藻兼而有之的动植物代谢途径
    1.3 甲藻的分子遗传学研究进展
    1.3.1 甲藻的表达序列标签分析
    1.3.1.1 表达序列标签分析概述
    1.3.1.2 其它藻类表达序列标签研究进展
    1.3.1.3 甲藻表达序列标签研究进展
    1.3.2 甲藻分子系统学研究进展
    1.3.2.1 核糖体RNA 基因及 ITS
    1.3.2.2 限制性片断长度多态性分析
    1.3.2.3 线粒体基因组、质体基因组基因及其它基因作为分子标记
    1.4 研究课题的提出及立项依据
    1.4.1 东海原甲藻cDNA 文库的构建及EST 分析研究课题的提出
    1.4.2 东海原甲藻系统学研究课题的提出
    2 东海原甲藻cDNA 文库的构建
    2.1 材料
    2.1.1 藻种培养
    2.1.2 藻类培养母液的配制
    2.1.3 试剂
    2.1.4 LB 培养基
    2.2 方法
    2.2.1 总 RNA 的提取及检测
    2.2.1.1 提取 RNA 实验用品及相关处理
    2.2.1.2 总 RNA 的提取
    2.2.1.3 总 RNA 的纯化
    2.2.1.4 总 RNA 的检测
    2.2.2 cDNA 的合成
    2.2.2.1 RNA 样品的预处理
    2.2.2.2 cDNA 第一条链的合成
    2.2.2.3 cDNA 第二条链的合成以及末端平滑化
    2.2.2.4 双链cDNA 的精制
    2.2.3 cDNA 的 PCR 扩增
    2.2.3.1 与接头的连接
    2.2.3.2 cDNA 的 PCR 扩增
    2.2.3.3 cDNA 的回收
    2.2.4 cDNA 文库的构建
    2.2.4.1 与质粒载体的连接
    2.2.4.2 电转化
    2.2.4.3 文库的保存
    2.2.5 重组子的筛选
    2.3 结果与讨论
    2.3.1 总 RNA 的提取
    2.3.2 cDNA 的合成与扩增
    2.3.3 连接及重组子的筛选
    2.4 小结
    3 东海原甲藻的 EST 分析
    3.1 材料
    3.2 方法
    3.2.1 EST 的测序
    3.2.2 EST 数据处理
    3.2.2.1 EST 分组
    3.3 结果与讨论
    3.3.1 EST 序列的分析
    3.3.1.1 EST 的分组
    3.3.1.2 EST 数据的分析
    3.3.2 几种重要的功能基因
    3.3.2.1 主体蛋白
    3.3.2.2 细胞核抗体蛋白
    3.3.2.3 1，5，-二磷酸核酮糖激酶
    3.3.3 Caspases 与浮游植物细胞程序化死亡
    3.3.3.1 浮游植物存在细胞程序化死亡的证据
    3.3.3.2 浮游植物基因组中的caspase 同源基因
    3.3.3.3 东海原甲藻存在细胞程序化死亡过程
    3.4 小结
    4 东海原甲藻线粒体细胞色素b 基因的克隆与分析
    4.1 材料
    4.2 方法
    4.2.1 DNA 的提取
    4.2.2 限制性切割和cassette 的连接
    4.2.2.1 DNA 的限制酶酶切反应
    4.2.2.2 连接反应
    4.2.3 东海原甲藻细胞色素b 基因的克隆
    4.2.3.1 东海原甲藻细胞色素b 基因的PCR 扩增
    4.2.3.2 切胶法回收PCR 扩增产物并纯化
    4.2.3.3 PCR 扩增片断的克隆
    4.2.4 克隆产物的测序与分析
    4.3 结果与分析
    4.3.1 DNA 的提取与酶切
    4.3.2 东海原甲藻cob 基因的PCR 扩增和克隆
    4.3.3 东海原甲藻cob 基因序列的组成及密码子的使用
    4.3.4 东海原甲藻与其它甲藻的cob 基因碱基和氨基酸序列的比较
    4.3.5 东海原甲藻与其它原甲藻cob 基因序列相比较碱基变异情况
    4.4 讨论
    4.5 小结
    5 东海原甲藻细胞色素氧化酶亚基 I 基因的克隆与分析
    5.1 材料
    5.2 方法
    5.2.1 DNA 的提取
    5.2.2 东海原甲藻细胞色素氧化酶亚基I 基因的克隆
    5.2.2.1 东海原甲藻cox1 基因的PCR 扩增
    5.2.2.2 切胶法回收PCR 扩增产物并纯化
    5.2.2.3 PCR 扩增片断的克隆
    5.2.3 克隆产物的测序与分析
    5.3 结果与分析
    5.3.1 东海原甲藻coxI 基因序列
    5.3.2 东海原甲藻与其它甲藻coxI 基因的碱基和氨基酸序列的比较
    5.3.3 东海原甲藻与其它原甲藻coxI 基因相比较碱基变异情况
    5.4 讨论
    5.5 小结
    6. 总结与创新点
    6.1 总结
    6.2 创新点
    参考文献
    在读期间发表和提交的论文
    致谢
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东海原甲藻基因表达特征研究

张秀芳
中国海洋大学
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引用
尽管东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)的命名仍存在分歧,但它是我国特有的赤潮藻种,最近几年已在长江口和舟山群岛产生大规模的赤潮,造成了重大的经济损失和给生态带来了重大的影响,由此引起人们极大的关注。　　近年来,有关它的生活史,生态,分类,形态等研究很多,但其分子生物学研究却非常少。为了在东海原甲藻中开展相关的分子遗传学研究,我们构建了人工培养状态下的东海原甲藻对数生长期细胞的cDNA文库。从随机选取的700个克隆获得了565条可用的序列。本论文报道了从这些序列中鉴定的功能基因,尤其是那些与细胞程序化死亡相关的基因。另外,我们还对线粒体细胞色素b基因及细胞色素氧化酶亚基I基因进行了克隆与分析。　　在东海原甲藻的cDNA文库构建中,使用UNIQ-10 Trizol Total RNA Preparation Kit来进行总RNA的提取,将cDNA Synthesis Kit和PCR cDNA Library Kit组合使用进行cDNA的扩增,最后,将cDNA与pMD18-T载体连接后转化到大肠杆菌JM109中。　　鉴定功能基因的一个比较恰当的途径是表达序列标签分析。实际上,这样的分析已经在许多真核生物中进行,被认为在某中程度上发挥与全基因组测序相同的作用。表达序列标签就是一段cDNA序列,能定义这些cDNA,但因为是单方向测序产物,不仅节约成本,也能获得与全长基因相似的信息。它们除了作为基因标签,也能用来比较转录物集合,做DNA芯片,尤其是鉴定功能基因。我们从东海原甲藻的cDNA文库中随机挑取克隆进行测序,得到565条EST这些序列可分为272个单一序列和36个重叠群(308个EST组)。在蛋白数据库中比较发现23组与已知功能蛋白相似的克隆,其中的大部分与能量代谢、转录/翻译及光合作用有关。　　有9组与甲藻中已知蛋白序列相匹配。另有14组与其它生物体中的已知蛋白序列相匹配。特别重要的是有两组EST分别与两个细胞程序化死亡的关键蛋白同缘,它们分别是半胱氨酰天冬氨酸特异蛋白酶(cysteine proteases)和分裂细胞核抗体（proliferating cell nuclear antigen）。赤潮形成浮游植物的繁殖和死亡是它们对应赤潮形成和消亡的微观过程。半胱氨酰天冬氨酸特异蛋白酶的鉴定初步证明了东海原甲藻存在细胞程序化死亡过程, 也为东海原甲藻的繁殖和死亡研究, 以及它形成的赤潮的爆发和消亡机制研究打下了一定的基础。被同时鉴定出来的还有一组代表分裂细胞核抗体蛋白的 EST。该蛋白与包括细胞程序化死亡在内的许多细胞过程相关. 如果没有该蛋白或者其浓度特别低,细胞就会进入程序化死亡。同样, 它的鉴定也有助于我们理解东海原甲藻赤潮形成的机制。我们还以相应引物LA PCR扩增了东海原甲藻线粒体细胞色素b基因（cob）和细胞色素氧化酶亚基 I 基因（coxI）片断，PCR产物经T载体连接后进行克隆、测序。得到的细胞色素b基因(cob)片断为1052bp，其 A,T,G,C含量分别为 45.9％，18.6%,24.2%和11.4%。细胞色素氧化酶I亚基基因（cox I）片断为1058bp，其A,T,G,C含量分别为 38.9%，17.9%,28.2%和15.0%。GC含量明显高于AT含量。我们将这两个片断与GenBank数据库中的甲藻目其它甲藻的cob片断和coxI片断进行了比较，发现甲藻的cob序列差异性相对明显，而coxI序列差异性较低。结果表明：相对于甲藻线粒体细胞色素氧化酶I基因，线粒体cob基因进化速度较快。另外基于这两个基因序列构建了系统树，对甲藻之间的进化关系做了初步分析。

东海原甲藻;基因表达;赤潮藻种;细胞程序化死亡;线粒体

中国海洋大学

博士

海洋生物学

杨官品

2006

中文

Q943.2;Q948.8

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2014-05-22（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）