铁蛋白在虾夷扇贝新品种―海大金贝‖高抗逆性中的作用及机理研究
1.“海大金贝”和普通虾夷扇贝的蛋白组学初步比较分析 与外界环境、病害生物和敌害生物相比，遗传结构是影响扇贝存活率的最根本的因素。为了保证扇贝养殖业的持续健康发展，需改善和培育高抗逆性的扇贝。近年来，分子标记辅助育种工作已被全面开展，对抗逆性分子标记的筛查也越来越多。本文以富含类胡萝卜素且具高抗逆性的虾夷扇贝新品种―海大金贝‖为材料，对其高抗性进行了分子机理的探索。本研究运用蛋白组学的方法对―海大金贝‖和普通虾夷扇贝雄性性腺中的差异蛋白进行了分析比较，最终得到7个差异蛋白点，即proteasome subunit alpha type-1(PS)，fructose-bisphosphate aldolase(FBA)，peroxisomal3,2-trans-enoyl-CoA isomerase(PECI)，chaperonin containing TCP1(CCT)，ferritin(FTN)，elongation factor1-beta(EF1B)和β-tubulin(TUBB)。同时，Real-time PCR分析表明其中四个基因（PS, FBA, PECI and CCT）的mRNA表达含量及其蛋白的含量在两种虾夷扇贝中是一致的。分析表明：1）这些差异基因参与了各种各样的生物过程，如脂类和糖类代谢过程、蛋白折叠和降解过程。2）类胡萝卜素累积可能影响了PPARs代谢通路，而使上述基因的表达发生了变化。3）铁蛋白FTN在先天免疫系统中的重要作用，可作为研究“海大金贝”高抗逆性的重要候选基因。本研究为海洋软体动物类胡萝卜素累积的研究开启了崭新的一页并奠定了一定的分子基础。 2.虾夷扇贝六种铁蛋白亚基的鉴定及特征分析 作为一种重要的铁离子储存蛋白，铁蛋白在维系胞内铁离子平衡和先天防御过程中起着重要的作用。本研究中，成功克隆了6个虾夷扇贝铁蛋白亚基（PyFer1, PyFer2, PyFer3, PyFer4, PyFer5和PyFer6）的cDNA及DNA序列；其中，PyFer1、PyFer2、PyFer3和PyFer4均由4个外显子和3个内含子组成，PyFer5由7个外显子和6个内含子组成，PyFer6则由5个外显子和4个内含子组成。在PyFer4和PyFer6第二个内含子区域，存在小卫星序列。除了PyFer5和PyFer6外，其余4个虾夷扇贝铁蛋白5'-UTR区域都含有铁反应调控元件IRE。与此同时，在PyFer2、PyFer4和PyFer6的3'-UTR区域分别存在3、17和1个A+U mRNA不稳定原件（TATT或ATTTA）。6种铁蛋白亚基ORF长度分别为522、516、516、519、687和663 bp，编码173、171、171、172、228和220个氨基酸。这些铁蛋白均含有典型的铁蛋白结构特征，即4个长α螺旋，1个短α螺旋，1个长环。生物信息学预测结果显示，PyFer1、PyFer2、PyFer3和 PyFer4不但含有铁氧化酶作用中心（E Y E E H E Q），还含有铁水合作用位点（D E E），而PyFer5仅含有铁氧化酶作用中心，PyFer6并不含有完整的铁氧化酶作用中心。PyFer1、PyFer2、PyFer3和PyFer4理化性质较为相似，属于胞质型可溶蛋白；而PyFer5和PyFer6铁蛋白N端含有信号肽序列，属于分泌型可溶蛋白。定量PCR分析显示，6种铁蛋白亚基在虾夷扇贝D型幼虫期表达量均有显著的提升，在成体虾夷扇贝外套膜和肝胰腺中的表达量较高。虾夷扇贝受铁或者鳗弧菌胁迫后，6种铁蛋白的表达量均有了显著的变化。重组蛋白（rPyFer1、rPyFer2、rPyFer3和rPyFer4）展示了明显的铁氧化酶和抑菌活性。细胞定位显示，铁蛋白广泛分布在虾夷扇贝不同细胞类型中。以上结果表明这6种铁蛋白可能参与了虾夷扇贝多个基础生理活动，如免疫应答、铁离子平衡和贝壳形成过程。 3.铁蛋白在“海大金贝”高抗逆性中的作用 作为一种重要的铁离子储存蛋白，铁蛋白参与了虾夷扇贝的免疫应答、铁离子平衡和贝壳形成等多个基础生理活动过程。本实验以普通虾夷扇贝和―海大金贝‖为材料，对两者经过铁或鳗弧菌胁迫后6种铁蛋白的反应灵敏度进行了比较，发现与普通虾夷扇贝相比，―海大金贝‖中的6种铁蛋白均表现出更敏感快捷的反应，表明铁蛋白可能在―海大金贝‖的高抗逆性中起着重要的作用。
铁蛋白;类胡萝卜素;抗逆性品种;虾夷扇贝
中国海洋大学
博士
海洋生物学
包振民
2013
中文
S968.3
123
2013-09-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）