载阿霉素组氨酸修饰透明质酸纳米粒的制备及抗肿瘤研究
透明质酸（HA）是一种天然多糖，具有良好的生物相容性、生物可降解性，已在药物输送和组织工程等领域得到广泛的应用。本论文合成了组氨酸修饰透明质酸耦合物，应用超声分散法制备载阿霉素纳米粒，进行细胞毒性和细胞摄入过程分析，以H22荷瘤小鼠为模型，阐明其药代动力学、组织分布以及抑瘤活性。 首先，以组氨酸（His）为配基，通过酰胺接枝反应合成了不同取代度的组氨酸修饰透明质酸耦合物（His-HA）；应用核磁共振法耦合物的结构特征进行了表征，利用荧光光谱法分测定 His-HA耦合物的临界聚集浓度（CAC），并分析不同pH值下耦合物的微结构变化。1H NMR图谱显示His成功地修饰到HA上；荧光图谱显示His-HA耦合物的CAC随着His取代度的升高而降低。 利用超声波分散法制备 His-HA纳米粒，应用动态激光散射仪测量 His-HA纳米粒的粒径分布和Zeta电位，并分析pH值对粒径、Zeta电位的影响，利用透射电镜对纳米粒形态进行形态观察。结果显示，随着His取代度的升高，His-HA纳米粒的平均粒径从780±56 nm下降到230±21 nm，另外，随着pH值的降低，His-HA粒径升高，显示His-HA纳米粒具有pH响应性。His-HA纳米粒的Zeta电位呈现负电性，其绝对值随着His取代度的升高而降低，随着溶液介质pH值的降低，纳米粒的Zeta电位绝对值降低。电镜图片显示His-HA纳米粒外观似球形，形态完整。 以阿霉素（DOX）为模型药物，制备了包载 DOX的His-HA纳米粒（DOX/His-HA），分析其载药量、包封率及体外释药规律。结果证明，随着取代度的提高，纳米粒的包封率增加，载药量增大。体外释药实验显示，载药纳米粒具有缓释效果，随着取代度增加，缓释效果增强；在酸性条件下，DOX/His-HA纳米粒的释药量增加，在pH6.0时，8 h累计释药率高达32.92％，48 h累计释药率高达51.87%。 MTT法考察了DOX/His-HA纳米粒对MCF-7细胞的毒性。制备FITC标记的纳米粒（FITC-His-HA），分析 FITC-His-HA纳米粒的细胞摄入特征。另外，探讨温度、pH值以及HA因素对MCF-7细胞摄入的影响。研究结果显示：随着DOX浓度的增加，自由DOX和DOX/His-HA纳米粒对MCF-7细胞的抑制率增加，细胞毒性也不断提高，呈现了药物浓度与作用时间的响应性。细胞摄入实验显示，FITC-His-HA纳米粒被MCF-7细胞摄取；DOX/His-HA纳米粒被细胞摄入，分散于细胞核和细胞质中。定量实验显示：在4℃下，MCF-7细胞对DOX的摄入量降低，但随着pH的降低，细胞摄入量增加。这说明细胞对DOX的摄取方式存在两种方式：受体介导的载药纳米粒的胞吞、载药纳米粒在胞外释放的DOX。竞争性细胞摄取实验显示：经 HA预处理后，MCF-7细胞对载药纳米粒的摄取量降低，说明DOX/His-HA纳米粒选择性地结合到CD44受体，并通过受体介导的内吞作用被MCF-7细胞摄入。 对His-HA纳米粒的生物相容性进行了分析，评价了His-HA纳米粒的细胞相容性、血液相容性。以人肝细胞L02为细胞模型，采用MTT法考察His-HA纳米粒的细胞毒性，通过溶血实验评价了His-HA纳米粒的血液相容性。实验结果显示：His-HA纳米粒具有较好的细胞相容性和血液相容性，满足医用生物材料的要求。 以H22荷瘤小鼠为动物模型，考察DOX/His-HA纳米粒的药代动力学和组织分布规律，并评价了其肝癌靶向性。实验结果显示：与DOX对照组相比，DOX/His-HA纳米粒组的t1/2β、AUC明显增加，MRT明显延长，而CL与Vc则明显降低。组织分布实验显示：与DOX对照组相比，DOX/His-HA纳米粒经尾静脉注射后，在肿瘤组织的DOX含量明显增加，显示具有肿瘤靶向性，并且随着取代度的增加，肿瘤靶向性增强。 以H22荷瘤小鼠为动物模型，以生理盐水为对照，考察DOX、DOX/His-HA纳米粒的抑瘤效果。对小鼠体重而言，DOX给药组的小鼠体重较对照组明显减轻(P<0.05)，DOX/His-HA纳米粒给药组的小鼠体重较对照组无统计学差异(P>0.05)；从抑瘤效果上，DOX和DOX/His-HA纳米粒给药后，肿瘤生长都得到抑制，其中，DOX/His-HA纳米粒给药组的抑瘤率为67.07%，与生理盐水组差异明显（P<0.01）。而在小鼠免疫力影响方面，与对照组相比，DOX/His-HA纳米粒给药组小鼠的胸腺指数，脾脏指数均没有明显差异（P>0.05）。而DOX给药组胸腺指数、脾脏指数明显降低（P<0.05）。这说明DOX/His-HA纳米粒可有效抑制肿瘤并降低了药物的毒副作用。
透明质酸;载阿霉素纳米粒;细胞毒性;药代动力学;抑瘤活性
中国海洋大学
博士
生物化学与分子生物学
刘晨光
2013
中文
R979.1
124
2013-09-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）