基于全基因组序列分析筛选罗非鱼源无乳链球菌ZQ0910株保护性抗原及其免疫保护性研究
链球菌(Streptococcus)是一种能感染多种宿主（人类、畜禽及水生动物等）并引起严重疾病的病原菌。近年来由无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）引起的鱼类链球菌病在我国南方罗非鱼主养区频频爆发，给该产业造成了巨大的经济损失，这迫使我们必须加强对无乳链球菌病害传播的预防和控制。疫苗是预防和控制传染性疾病的最有效手段之一，然而在罗非鱼源无乳链球菌毒力因子和致病机理尚不清楚的前提下，该菌亚单位疫苗的研制也受到了制约，迄今仍未开发出有效的渔用无乳链球菌亚单位疫苗并应用到生产实践中。 基于此，本研究采用多位点序列分型（Multilocus sequence typing，MLST）方法对2010-201年收集鉴定的104株罗非鱼源无乳链球菌进行基因水平的分型，确定不同地区分离的无乳链球菌（S.agalactiae）主要基因类型，并与国际上流行的菌株进行比较，获得了它们的遗传背景和变异趋势等信息；在分型结果的基础上选取6株具有区域和分型代表性的菌株在罗非鱼鱼体上进行了致病性分析，筛选出具有良好免疫原性的菌株作为疫苗制备菌株。采用“鸟枪法”对筛选的无乳链球菌ZQ0910株进行了全基因组测序，并开展了序列分析及基因注释等工作；从2022个ORF中筛选了5个疫苗候选蛋白分子，利用基因工程技术对其进行了表达纯化，同时进行了罗非鱼活体实验；此外，我们将sip基因作为抗原基因，成功构建了真核表达质粒pcDNA-sip并在鱼体上进行了免疫保护性实验。 具体研究内容及结果如下： 1、2010-2011年间，通过实地走访调查，从我国南方三省（广东、广西、海南）罗非鱼主养区患病罗非鱼体内收集分离了104株罗非鱼源无乳链球菌（S.agalactiae），并对这104株链球菌进行了生理生化及分子生物学鉴定。 2、采用多位点序列分析（MLST）技术对上述104个无乳链球菌（S.agalactiae）分离株进行分型。结果表明，104个分离株可分为3个不同的序列型（ST-7、NST-1及NST-2）。其中，常规型ST-7共8株，新的基因型NST-192株，NST-24株；等位基因图谱表明，两个新的序列型与 ST-7型的亲缘关系非常相近，属同一个克隆复合物。 3、南方地区罗非鱼源无乳链球菌（S.agalactiae）6个不同分离菌株的致病性分析结果表明，广东肇庆分离株ZQ0910相对于其他菌株对罗非鱼具有较强的致病力，这也说明该菌株具较好的免疫原性，可有效刺激机体产生免疫应答。 4、采用“鸟枪法”测序策略对罗非鱼源无乳链球菌 ZQ0910株进行了全基因组测序，并进行了序列分析及基因注释。相关数据提交至DDBJ/EMBL/GenBank数据库,基因登陆号为AKAP00000000。 5、以无乳链球菌（S.agalactiae）ZQ0910全基因组序列为基础，应用生物信息学软件和公用生物网站上的工具，对无乳链球菌（S.agalactiae）ZQ0910株全基因组编码的2022个ORFs逐个进行了比对搜索，获得了21个与致病性或免疫原性相关的蛋白。经文献查阅和筛选，最终确定5个蛋白分子作为后续保护性抗原研究的靶蛋白，分别为：SIP、Hemolysin、FBP、VaA、HtrA。 6、将上述5个候选蛋白基因分别克隆到原核表达载体pET28a(+)和pET32a(+)上，转化大肠杆菌Rosetta中，获得了5个表达候选分子的重组工程菌（pET32-Sip、pET28-Hemolysin，pET28-Fbp，pET28-VaA，pET28-HtrA）。采用 Ni-NTA亲和层析纯化了5个重组工程菌的诱导表达蛋白。 7、将以上5个纯化蛋白分别免疫吉富罗非鱼（Oreochromis niloticus）以检测其对鱼体的免疫应答能力。研究结果表明，5个疫苗候选蛋白分子均能提供有效的保护力，其中以SIP组效果最好，免疫保护率达到80％。此外，HtrA组、FBP组、Hemolysin组和VaA组的免疫保护率分别为75%、74%、70%和70%。 8、将Sip基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+)构建重组质粒pcDNA-Sip，并以肌肉注射方式免疫吉富罗非鱼（O.niloticus）。分别于免疫后第7和28d取样，采用PCR及RT-PCR方法检测pcDNA-Sip在各个组织（包括肌肉、脾脏、头肾、鳃及肝脏）中的表达情况；分别于免疫后第7、14、21及28 d采集血清，使用ELISA方法检测抗体效价；同时，免疫28d后进行攻毒实验以计算疫苗的免疫保护率。研究结果表明，在肌肉、脾脏、头肾、鳃及肝脏组织中均能检测到pcDNA-Sip的表达；免疫21d后抗体效价出现峰值，达1：5120，免疫保护率为90%。由此证实，pcDNA-Sip重组质粒可以转染到罗非鱼组织细胞，并可在鱼体中持续表达，同时具有较高的免疫保护率。
全基因组序列;罗非鱼;免疫保护性;无乳链球菌
中国海洋大学
博士
水产养殖
吴灶和
2013
中文
S943;S965.125
149
2013-09-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）