磁珠富集法筛选大叶藻(Zostera marina L.)微卫星分子标记
大叶藻(Zostera marina L.)是北半球分布最广泛的海洋开花植物，它能够为多种多样的海洋生物提供栖息地和食物，是海洋生态系统的重要组成部分。在群居生活为主的海洋中，大叶藻的繁殖生长给众多海洋生物提供了生存和栖息的生态环境，由于沿海发展造成的破坏、日趋劣化的水质以及气候的变化，导致大叶藻资源极速下降。近几十年，全球普遍关注大叶藻场的研究与保护，并广泛开展大叶藻草场修复和重建工作。微卫星DNA标记是快速考察群体遗传多样性与结构特征的有效工具，该工具的应用为科学的保护和可持续的利用大叶藻种质资源提供了重要依据。目前，已有的大叶藻微卫星DNA标记数量很少，不能满足研究的需要。 本研究根据生物素与链霉亲和素的亲和原理，通过磁珠富集的方法分离大叶藻的微卫星DNA标记。将大叶藻基因组DNA经MseI酶切，1％琼脂糖电泳，回收纯化100～800bp片段。连接相应的接头，采用AFLP接头特异性引物进行PCR一次。并将PCR产物与用生物素标记的简单重复序列(AC)15作探针进行杂交，杂交复合物与包被有链霉亲和素的磁珠相互结合，经过洗涤后，将磁珠表面不含有微卫星的片段去除。然后将吸附在磁珠上的片段通过热变性和碱变性两种方式洗脱下来，然后将这些片段PCR扩增形成双链，连接到连接载体 pMD18-T中，转化到感受态细胞E.coliDH5α中构建富集微卫星序列的小片段插入文库。用PCR法筛选文库，获得阳性克隆360个。然后经测序分析，获得103个微卫星序列。除探针中使用的(AC)n重复单元外，还观察到(TGG)n、(AG)n、(AGG)n的重复序列。设计出68对引物，其中32对引物在大叶藻基因组中得到成功扩增，这其中19对引物检测出多态性。其中哈温伯格平衡连锁不平衡检验结果显示，微卫星标记Pzm27和Pzm49不符合哈温伯格平衡，微卫星标记Pzm23和Pzm47紧密连锁（P＜0.0003）。MicroChecker结果显示标记Pzm75存在无效等位基因。本研究开发的新的大叶藻微卫星DNA标记将进一步应用在大叶藻遗传学和生态学研究中，为大叶藻种质资源的保护和开发奠定基础。
磁珠富集法;大叶藻;微卫星分子标记;种质资源
中国海洋大学
硕士
农业推广
李琪
2013
中文
S917.3
41
2013-09-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）