海洋弧菌QY105中褐藻胶裂解酶的研究
随着人类对资源的需求量日益增加，造成地球能源接近枯竭，所以各国政府开始关心重视新能源的开发利用。在新能源中生物能源备受关注，从海藻中获得生物能源以其不占用土地，不争用粮食供给，不需洁净水源，不使用肥料等优点而更为突出。并且在一些国家，褐藻已经进行了大规模的养殖，每年产生褐藻干重1500万公吨，我省仅荣成市年均生产鲜海带可达100余万吨，就为褐藻产生生物能源提供了丰富的原料。 褐藻主要有三种组成成分：葡萄糖、甘露醇和褐藻胶，大肠杆菌自身可以利用葡萄糖和甘露醇，却无法利用褐藻胶。褐藻胶是由β-D-甘露糖醛酸（β-D-mannuronate acid，M）及其C5差向异构体α-L-古罗糖醛酸（α-L-guluronate acid，G）两种糖醛酸单体通过1，4糖苷键聚合而成的一种水溶性酸性多糖。褐藻胶的聚合方式有三种：由多聚β-D-甘露糖醛酸构成均聚物（polyM）；由多聚α-L-古罗糖醛酸构成均聚物（ployG）；由β-D-甘露糖醛酸与α-L-古罗糖醛酸组成的MG随机交替片段（polyMG）。 褐藻胶裂解酶能以β消除方式催化降解褐藻胶，在非还原性末端生成带有C4,5双键的4-deoxy-L-erythro-hex-4-enopyranosyluronic acid结构，该结构在230-240 nm下有强烈的吸收峰。褐藻胶裂解酶根据其降解底物专一性的不同可分为三类：专一性裂解polyM片段的裂解酶（EC4.2.2.3），专一性裂解polyG片段的裂解酶（EC4.2.2.11），以及两种片段都可裂解的双功能裂解酶。目前发现的褐藻胶裂解酶多具有 polyM底物偏好性，为了更好更彻底的降解利用褐藻，发现具有polyG底物偏好性的褐藻胶裂解酶及研究褐藻胶寡糖酶具有重要意义。 本文筛选得到产酶高，且具有 polyG底物偏好性的菌株，命名为 QY105。通过16S rDNA基因序列比对确定QY105为弧菌属，即Vibrio sp. QY105。 QY105发酵周期短，在发酵到15 h时，发酵上清中具有polyG底物偏好性的褐藻胶裂解酶酶活几乎达到最高酶活的90％，发酵20 h即可达到最高酶活。其发酵上清经过硫酸铵沉淀、疏水层析、离子交换层析三步分离纯化即可达到电泳纯水平，其分子量为37 kDa。AlyV5的得率为7.5%，被浓缩了23.6倍，比活力为2152 U/mg。 AlyV5最适温度为38℃，在pH7.0的Tris-HCl缓冲体系中酶活最高。AlyV5在60℃保温1 h或90℃保温10 min后，其剩余酶活可达到原来的40%。AlyV5在pH6.0-9.0的缓冲体系中4℃存放12 h后仍保持80%的酶活力。NaCl对酶活有明显的促进作用，没有NaCl的反应体系中几乎测不到酶活；K+、Li+、NH4+对于酶的活性无明显影响；Mg2+、Ca2+、Mn2+对酶活有促进作用，Cu2+、Fe3+对于该酶的活性有明显的抑制作用；其余金属离子对 AlyV5的酶活力有不同程度的抑制作用；而1 mM的SDS对于酶活的影响不大，EDTA却明显抑制AlyV5的酶活力。 在底物特异性研究中，AlyV5对 polyG具有偏好性，但同时也可以降解polyM，并且降解polyG的终产物主要为二、三、四糖，而降解polyM最终产物主要为三、四、五糖。因此，AlyV5所能降解的最小寡糖为 polyG的五糖单元及polyM的六糖单元。将其与polyM偏好性褐藻胶裂解酶混合使用，测得的酶活比混合后的理论值高出2倍。 为了进一步研究褐藻胶的代谢过程，在研究了褐藻胶裂解酶AlyV5的性质后，我们对其内部的褐藻胶寡糖酶进行了克隆，通过简并PCR及SiteFinding-PCR，得到了三个褐藻胶寡糖酶的全基因序列，通过序列比对分析后，我们发现这三种褐藻胶寡糖酶在弧菌中具有高度保守性。 这些酶的发现，将加快利用褐藻胶生产生物乙醇的进程，为解决能源危机提供新的思路。
海洋弧菌;褐藻胶裂解酶;全基因序列;催化降解机制
中国海洋大学
硕士
微生物与生化药学
于文功
2013
中文
TQ925.9
88
2013-09-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）