海洋源金属硫蛋白的提取、纯化和检测
金属硫蛋白（metallothionein，MT）广泛存在于人体、动物、植物以及微生物中，是一种高金属含量、无芳香族氨基酸、低分子量、富含半胱氨酸的功能独特金属结合蛋白。具有清除自由基、抗击电离辐射、重金属解毒、参与微量元素代谢、机体应激反应和增强机体对不良状态适应能力等功能。广泛应用于食品、医药、保健、生物工程等领域。MT规模化生产主要以兔肝诱导，但其资源有限，产量低。 本研究以鱼下脚料鱼肝作为MT提取源，提取鱼肝中的MT，通过多级膜分离技术对提取液进行粗分离，采用凝胶层析和离子交换层析对MT粗品进一步精细分离。同时，以兔肝MT作为检测标准品，分别建立了紫外和HPLC两种检测方法，用以确定提取液中MT含量。主要研究结果如下： 1.以兔肝MT作为标准品，采用5,5ˊ-二硫硝基苯甲酸（DTNB）作为MT巯基衍生化试剂，通过优化反应条件，应用比色法测定412nm处显色产物硫代硝基苯甲酸阴离子（TNBA）的量确定金属硫蛋白含量。结果表明：MT含量在2~15μg和10~150μg范围内呈良好线性，线性回归方程分别为A412=0.0059C+0.0251和 A412=0.0052C+0.0201，相关系数分别为 R2=0.9942和R2=0.9997，平均回收率为99.94％（n=6，RSD=0.27%），精密度良好（n=6，RSD=0.7%），MT最低定量限可达到2μg，从而建立了一种操作简便易行的金属硫蛋白快速检测方法。 2.以兔肝MT作为标准品，采用4-氟-7-硫代苯并呋喃铵（SBD-F）衍生化试剂作为荧光反应试剂，流动相为20mmol/L pH=7.5的磷酸钾缓冲液，乙腈，甲醇体积比为80:18:2，流速0.5ml/min，激发波长380nm，发射波长510nm，检测SBD-F与MT衍生反应产物的荧光强度。结果表明：MT含量在0.02ug/ul~0.2ug/ul的范围内呈现良好的线性关系，线性回归方程y=4.3E+7x-9.6E+5，相关系数R2=0.9983，平均回收率98.03%（n=6，RSD=1.76%），精密度良好（n=6，RSD=2.21%），MT的检测限5ng，最低定量限达7.5ng，从而建立了一种高效精确的检测金属硫蛋白含量的方法。 3.采用匀浆离心法提取鱼肝中MT，以Tris-HCl作为提取缓冲液，以每克鱼肝中提取的MT含量作为响应值，通过单因素试验确定对响应值影响较大的四个因素，在四因素三水平的基础上，通过响应面试验优化提取条件。确定最佳提取条件：提取液pH=8.5，提取温度46℃，Tris浓度0.25mol/L，物料比1/7。 4.运用多级膜分离技术对鱼肝MT匀浆提取液进行粗步纯化，先通过0.1um陶瓷膜将匀浆液中的颗粒比较大的杂质去除，然后将透过液通过30K的CV材质的平板膜，去除大分子蛋白等杂质，收集透过液，通过2K卷式膜，收集浓缩液，浓缩，冻干，得到MT粗品。 我国鱼类资源丰富，每年都产生大量鱼下脚料，而对其利用率却非常低。以鱼下脚料作为MT提取源，提取其中的MT并进行产业化生产，不仅具有较高的经济效益，还有生态效益。
金属硫蛋白;鱼肝;膜分离技术;含量检测
中国海洋大学
硕士
食品工程
徐玮
2013
中文
TS201.21
77
2013-09-02（万方平台首次上网日期，不代表论文的发表时间）